甲狀腺激素受體β新同功體TRβ△的初步研究.pdf

1、甲狀腺激素(thyroidhormone)通過(guò)與廣泛分布在各種組織中的甲狀腺激素受體(thyroidhormonereceptors,TRs)結(jié)合，作用于轉(zhuǎn)錄過(guò)程實(shí)現(xiàn)其對(duì)靶基因的正性/負(fù)性調(diào)節(jié)，對(duì)于機(jī)體的正常分化發(fā)育和代謝平衡具有十分重要的作用。TR存在主要兩種亞型：TRa和TRβ。TRβ又分TRβ1，TRβ2，TRβ3和TRβ△3等同功體。 在進(jìn)行國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30271154)關(guān)于TRβ基因的研究中，需要對(duì)大鼠TRβ

2、1受體cDNA進(jìn)行克隆。TRβ1基因在多種組織中均有表達(dá)，其中肝臟、腦、骨胳肌、心臟、腎臟表達(dá)最多。取大鼠肝臟提RNA，以提取的RNAs為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。并以之為模板PCR擴(kuò)增TRβ1雙鏈cDNA。將該cDNA插入pGEM-Teasy載體，并進(jìn)行DNA序列分析。序列比較發(fā)現(xiàn)其與預(yù)期之TRβ1有很大不同，即在3'和5'兩端有同源性但在相當(dāng)于兩個(gè)外顯子3和4序列之間多出一段本是內(nèi)含子的108bp序列。此段序列并不是來(lái)源于變化點(diǎn)

3、(changingpoint)之前，而是來(lái)自于甲狀腺激素受體β基因3，4“共有”外顯子之間的非表達(dá)的內(nèi)含子序列內(nèi)，通過(guò)對(duì)其序列進(jìn)行分析我們發(fā)現(xiàn)，此部分很可能是另外一種在變化點(diǎn)之后剪切方式所產(chǎn)生的新的mRNA或在內(nèi)含子3，4之中還存在另一個(gè)外顯子。此意外發(fā)現(xiàn)的加長(zhǎng)型的新的TR同功體mRNA在NCBI的GeneBank注冊(cè)時(shí)，獲準(zhǔn)登記號(hào)為DO191165，命名此新同功體為TRβ△。此發(fā)現(xiàn)具有非常重要的科學(xué)意義：其一，目前發(fā)現(xiàn)的所有的九種TR

4、亞型中，沒(méi)有任何一種是加長(zhǎng)型的，只有截短型的(△α1、△α2和△β3)，我們發(fā)現(xiàn)的這一個(gè)新亞型β△是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種加長(zhǎng)型的TR亞型。其二，目前公認(rèn)的TRβ基因中有一個(gè)變化點(diǎn)，其5'端的(即上游)部分在轉(zhuǎn)錄中的剪切方式是高度可變的，因此產(chǎn)生了β1、β2、β3、△β3四種T3受體亞型，而其3'端的部分在轉(zhuǎn)錄中在脊椎動(dòng)物體內(nèi)又是高度保守的，而本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新的改變恰好發(fā)生在變化點(diǎn)之后(下游)的外顯子3和4之間，因此對(duì)原有變化點(diǎn)是否存在提出

5、了新的質(zhì)疑。第三，很可能在內(nèi)含子3，4之內(nèi)，存在一個(gè)過(guò)去被忽略而新被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新外顯子。TRβ的全基因組將要修正之。 通過(guò)軟件預(yù)測(cè)分析TRβ△與TRβ1的mRNA以及蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)與功能上有什么不同。將編碼TRβ△的基因片段分別克隆到表達(dá)載體pQE-30Xa上，并轉(zhuǎn)化入E.coliM15[pREP4]，進(jìn)行融合表達(dá)。Westernblotting鑒定重組蛋白。目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹(shù)