Bcl-x選擇性剪接微基因報(bào)告方法的建立.pdf

1、分 類 號(hào) :UD C :密 級(jí) :學(xué) 號(hào) : 104 110 20 7228南 昌 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 研 究 生學(xué) 位 論 文B。 卜x 選 擇 性 剪 接 微 基 因報(bào) 告 方 法 的建 立E sta b lish m e n to fth eM in ig e n eM e th o dfo rR e P 0 r tin gth eAl te r n a tiv eS P lic in go fB c l· x

2、黃 波培 養(yǎng) 單 位 ( 院 、 系 ) : 南 昌 大 學(xué) 第 二 附 屬 醫(yī) 院指 導(dǎo) 教 師 姓 名 、職 稱 : 王 小 中 副 教 授中請(qǐng) 學(xué) 位 的 學(xué) 科 門(mén)類 : 醫(yī) 學(xué)學(xué) 科 專 業(yè) 名 稱 : 臨 床 檢 驗(yàn) 診 斷 學(xué)論 文 答 辯 日期 : 201 0 年 6 月答 辯委員 會(huì)主 席 三 劍 魚(yú) 望 一評(píng) 閱 人20 10 年 6 月摘 要落 、提 取 質(zhì) 粒 及 雙 酶 切 ，測(cè) 序 鑒 定 所 構(gòu) 建 的質(zhì)

3、粒 ， 即 bel一 x 微 基 因 ;3. 反 向 P C R 法 構(gòu) 建 bel一 x 基 因重 要 順 式 元 件 C R C E I、C R C E Z 、B ZG 的突 變微 基 因 : 以鑒 定無(wú) 誤 后 的 Pc D N A 3. l(一 關(guān) be l 一 x 微 基 因?yàn)槟?板 ，通 過(guò) 設(shè) 計(jì) 致 使 順 式元 件 C R C E I、C R C E Z 、B ZG 發(fā) 生 突 變 的 引物 ，進(jìn) 行 反 向 p C

4、R ; 然 后 用 酶 D pnl對(duì) 模 板 質(zhì) 粒 D N A 進(jìn) 行 消 化 ，并 使 P C R 產(chǎn) 物 產(chǎn) 生 自身 環(huán) 化 反 應(yīng) ，最 后 將 環(huán) 化 后的 P C R 產(chǎn) 物 轉(zhuǎn) 化 感 受 態(tài) 細(xì) 菌 ，篩 選 陽(yáng)性 菌 落 、提 取質(zhì) 粒 進(jìn) 行 酶 切 、測(cè) 序 鑒 定 。4. R T-P C R 監(jiān) 測(cè) be卜 x 微 基 因及 其 突 變 微 基 因在 H L 60 細(xì) 胞 內(nèi) 的轉(zhuǎn) 錄 : 將 構(gòu) 建好 的 b

5、c l一 x 微 基 因及 其 突 變 微 基 因用 脂 質(zhì) 體 (hPo fectam i neZOOO)轉(zhuǎn) 染 的 方 法 轉(zhuǎn) 染H L 60 細(xì) 胞 ，轉(zhuǎn) 染 48 小 時(shí)后 用 T R N zo l 提 取 細(xì) 胞 總 R N A ，并 行 逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng) 得 到cD N A ，以 cD N A 為模 板 設(shè) 計(jì)特 異 引物 進(jìn) 行 P C R 反 應(yīng) ， 檢 測(cè) 細(xì) 胞 中 be l一 xL/be l 一 x sm R N

6、 A 水 平 的變 化 。研 究 結(jié) 果 :1: 經(jīng) 瓊 脂 糖 凝 膠 電泳 顯 示 : P C R 反 應(yīng) 擴(kuò) 增 出正 確 大 小 的 be l一 x 基 因 組 片 段(PIP 2 ， P 3 P 4 ) ;2 : 經(jīng) 酶 切 ，測(cè) 序 實(shí)驗(yàn) 鑒 定 后 ，構(gòu) 建 的微 基 因 Pc D N A 3.1C )一 be l 一 x 中沒(méi) 有 發(fā) 現(xiàn)錯(cuò) 誤 的堿 基 突 變 ; 微 基 因 pe D N A 3.1C )一 bcl

7、一 x 瞬 時(shí)轉(zhuǎn) 染 H L 60 細(xì) 胞 后 ， 能 夠 在 細(xì)胞 內(nèi)進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 ;3 : bel一 x 微 基 因 的 突 變 體 peD N A 3.1C )一 bel一 x 一 C R C E I(M ) 、p cD N A 3· 1C )一 bcl 一 x一 C R C E Z(M )、p eD N A 3.1C )一 bel一 x 一 B ZG (M) 經(jīng) 酶 切 ，測(cè) 序 鑒 定 沒(méi)有 發(fā) 現(xiàn) 錯(cuò) 誤 突 變

8、 ; 每 個(gè) 突變 微 基 因 瞬 時(shí)轉(zhuǎn) 染 H L 60 細(xì) 胞 后 ，均 能夠 在 細(xì) 胞 內(nèi)進(jìn) 行轉(zhuǎn) 錄 ;4 : RT 一 P C R 實(shí)驗(yàn) 表 明 : bel 一 x 微 基 因轉(zhuǎn) 染 H L 60 細(xì) 胞 后 be l 一 xL/be l 一 x s 為 1. 4 ，bcl 一 x 基 因順 式 作用 元 件 B ZG 、C R C E I、C R C E Z 對(duì) bel 一 xL /bel 一 x s 有 一 定 影 響

9、，p eD N A 3.lC )一 bel 一 x一 B ZG (M ) 、p eD N A 3.lC )一 bel 一 x 一 C R C E I (M ) 轉(zhuǎn) 染 H L 60 細(xì) 胞后 ，R T 一 P e R 電泳 結(jié) 果 顯 示 bel一 x s 幾 乎 消 失 ; p eD N A 3.lC )一 bcl 一 x 一 C R C E Z(M )轉(zhuǎn) 染H L 60 細(xì) 胞 后 ，R T 一 P C R 電泳 結(jié) 果 顯 示 b