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文檔簡介
1、一、研究背景: 胰腺癌是一種惡性程度很高的惡性腫瘤,發(fā)病率在國內外均呈上升趨勢,目前居消化道癌癥死因的第2位,5年生存率低于4%。早期的侵襲和轉移是胰腺癌的重要特征以及不良預后的關鍵因素。目前認為,信號分子的異常激活在腫瘤侵襲轉移中起重要作用,其中,以非受體酪氨酸激酶Src超家族及相關信號分子的活化尤為矚目。非受體酪氨酸激酶Src超家族是由Src、Fyn、Yes、Lyn等成員組成的,該超家族在細胞的增殖、分化、有絲分裂、凋亡等過
2、程中起非常重要的作用。研究顯示幾乎所有的實體瘤均存在Src的高表達及過度激活,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。而作為Src家族成員之一的Fyn,可見于腦腫瘤及頭頸部腫瘤中表達增高的相關報道,提示Fyn亦可以參與腫瘤侵襲轉移。然而,目前尚未見Fyn參與胰腺癌侵襲轉移及其分子機制的相關研究。 在腫瘤侵襲轉移的過程中,瘤細胞需要從原位脫落進入血液循環(huán)而到達靶器官,只有具備抗失巢凋亡特性的腫瘤細胞才能在靶器官中生長,并最終形成轉移灶。因此,
3、對凋亡的調控可以直接影響腫瘤細胞的侵襲轉移能力。盡管目前的研究普遍認為,非受體酪氨酸激酶能夠通過調控細胞凋亡,進而影響腫瘤侵襲轉移,但具體的機制仍不清楚。腫瘤細胞抗失巢凋亡的本質是相關信號分子異?;罨?,影響細胞內凋亡相關基因的表達。在眾多的凋亡相關基因中,由于Bcl-X能夠在不同情況下,經(jīng)選擇性剪切形成兩種作用相互拮抗的產(chǎn)物,因而備受關注。Bcl-X是Bcl-2家族成員,該基因轉錄后經(jīng)過不同的剪切方式形成Bcl-X(L)和Bcl-X(s
4、)兩種剪切體。其中Bcl-X(L)表現(xiàn)出明顯的抗凋亡作用;而Bcl-X(s)缺少了與Bcl-2具有高度同源性的63個氨基酸,表現(xiàn)出促進凋亡的作用。然而,Bcl-X基因發(fā)生選擇性剪切的機制尚不清楚。 目前研究認為酪氨酸激酶Fyn并不能直接參與RNA剪切的調控。Fyn作為一個多功能的激酶,可以通過其蛋白質結構域與下游信號分子結合并發(fā)揮作用,實現(xiàn)對靶基因的調控。值得注意的是,非受體酪氨酸激酶Src超家族與RNA結合蛋白hnRNPs(h
5、eterogeneous nuclear ribonucleoprotein,核內不均一性核糖核蛋白)、Sam68之間存在著相互作用。hnRNPs、Sam68可以作為非受體酪氨酸激酶的底物,受到激活后,通過結合在基因的Pre-mRNA序列上,在轉錄后水平進行調控,從而影響細胞的生物學行為。 綜合近年來國內外的研究結果,我們設想蛋白酪氨酸激酶Fyn通過激活結合于Bcl-X基因Pre-mRNA序列上的Sam68、hnRNP A2/B
6、1兩個RNA結合蛋白,參與Bcl-X的選擇性剪切,改變Bcl-X兩種功能相互拮抗的剪切體比例,影響細胞凋亡,調控胰腺癌的侵襲轉移。 二、目的: 本實驗的目的主要分為兩個部分,一方面是明確非受體酪氨酸激酶Fyn在胰腺癌侵襲轉移中的作用;另一方面是探究Fyn是否通過激活其下游靶信號分子hnRNPA2/Bl、Sam68,從而參與Bcl-X基因的選擇性剪切的調控,并闡明其分子機制。明確以上信號通路及調控機制將有助于深入理解胰腺癌
7、侵襲轉移的分子機制,并為尋找干預胰腺癌侵襲轉移的靶點提供幫助,最終將有助于改善胰腺癌患者的預后。 三、材料與方法: 1、通過免疫組化、Real-Time PCR的方法對28例胰腺癌Fyn的表達情況進行分析,并明確其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間關系。用放射性同位素P32標記的方法對三種侵襲轉移能力不同的胰腺癌細胞進行Fyn激酶活性測定,明確Fyn活性與胰腺癌侵襲轉移能力之間的關系。 2、將攜帶激酶活性缺失的KD-Fyn
8、( Kinase Dead-Fyn)的腺病毒轉染BxPC3胰腺癌細胞,用放射性同位素P32標記的方法進行Fyn激酶活性測定。MTT、Transwell侵襲實驗、TUNEL法分別檢測抑制Fyn活性前后BxPC3細胞增殖、侵襲能力以及凋亡水平的改變。RT-PCR檢測Bcl-X基因兩種剪切體比例的變化。并進一步將轉染KD-Fyn前后的BxPC3細胞注射于裸鼠皮下,制作裸鼠成瘤模型,通過對胰腺癌肝臟轉移情況的觀察,在體明確抑制Fyn活性對BxP
9、C3細胞侵襲轉移能力的影響。 3、將轉染KD-Fyn前后的BxPC3細胞進行聚丙酰胺二維凝膠電泳,并通過質譜分析,尋找出蛋白質差異點。通過Western-Blot的方法,對轉染KD-Fyn前后BxPC3細胞中該蛋白的表達水平進行檢測。采用磷酸化的蛋白抗體PY20,對轉染KD-Fyn前后Sam68的磷酸化水平進行檢測。并通過免疫共沉淀的方法,檢測Fyn與篩選出的差異蛋白、Sam68是否存在細胞內結合關系。 4、通過免疫組化
10、的研究方法對26例胰腺癌hnRNP A2/B1的表達情況進行分析,并明確其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系。通過RNA-免疫共沉淀技術,檢測篩選出的差異蛋白hnRNP A2/B1是否與Bcl-X基因的Pre-mRNA結合并證實磷酸化水平變化對Sam68的Bcl-X結合能力的影響。構建重組hnRNP A2/Bl及hnRNP A2/B1 RNAi腺病毒載體,并通過改變hnRNP A2/B1的表達水平,觀察對Bcl-X兩種剪切體比例的影響。
11、 五、結果及結論: 1、28例胰腺癌組織標本中有24例出現(xiàn)Fyn的表達,表達水平與胰腺癌TNM分期、是否發(fā)生遠處轉移相關,而與腫瘤大小、分化程度沒有明顯的關系。在BxPC3、Paca2、Aspcl三種侵襲轉移能力不同的胰腺癌細胞中,F(xiàn)yn的活性與侵襲轉移能力呈正相關。以上結果證實:Fyn胰腺癌侵襲轉移密切相關。 2、轉染KD-Fyn以后,F(xiàn)yn激酶活性明顯下降。MTT證實,抑制Fyn活性,明顯抑制了胰腺癌細胞增殖;T
12、ranswell實驗證實,抑制Fyn活性,明顯降低了胰腺癌細胞侵襲運動能力。TUNEL染色顯示,抑制Fyn活性,BxPC3胰腺癌細胞凋亡發(fā)生率明顯增加。在裸鼠成瘤實驗中,抑制Fyn活性可以明顯抑制BxPC3胰腺癌細胞在裸鼠中的成瘤能力。RT-PCR證實,抑制Fyn活性明顯改變了凋亡相關基因Bcl-X的選擇性剪切方式,其中促進凋亡的Bcl-X(s)明顯增加,抑制凋亡的Bcl-X(L)明顯降低。以上結果揭示了當抑制Fyn的激酶活性,可以下調
13、胰腺癌細胞的侵襲轉移能力,而這種作用是通過影響B(tài)cl-X基因選擇性剪切方式改變,進而影響胰腺癌細胞凋亡實現(xiàn)的。 3、聚丙酰胺二維凝膠電泳篩選出了轉染KD-Fyn前后的BxPC3細胞中表達量發(fā)生改變的多個差異點蛋白,免疫共沉淀技術證實其中的差異點蛋白hnRNP A2/B1及另一個RNA結合蛋白Sam68能夠分別與Fyn結合。Western-Blot證實,抑制Fyn的活性,hnRNP A2/B1表達水平下降;Sam68的磷酸化水平下
14、降。以上結果證實:Fyn可以結合并調控其下游靶信號分子hnRNP A2/B1的蛋白表達水平及Sam68的磷酸化水平。 4、將hnRNP A2/B1基因及hnRNP A2/B1 RNAi質粒成功克隆入Ad-Easy腺病毒載體中,獲得包含hnRNP A2/B1及hnRNP A2/B1 RNAi的重組腺病毒。該腺病毒可以高效干預hnRNP A2/B1在BxPC3胰腺癌細胞中的表達。 5、28例胰腺癌組織標本中有23例出現(xiàn)hnR
15、NP A2/B1的表達,表達水平與胰腺癌TNM分期、是否發(fā)生遠處轉移相關等因素有關,而與腫瘤部位、分化程度等沒有明顯的關系。RNA-免疫共沉淀證實,hnRNP A2/B1、Sam68能夠與BxPC3細胞中Bcl-X基因的Pre-mRNA結合。磷酸化水平的改變可以影響Sam68與Bcl-X基因的結合能力;而hnRNP A2/B1表達水平的改變可以影響B(tài)xPC3胰腺癌細胞中Bcl-X兩種剪切體的比例 綜合以上實驗結果,我們發(fā)現(xiàn)了Fy
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