RNA干擾抑制胰腺癌細胞SURVIVIN表達并誘導細胞凋亡的研究.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，其患病率在世界范圍呈上升趨勢，預后極差。目前，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，與胰腺癌有關的新的癌基因、抑癌基因和抗凋亡基因不斷被發(fā)現和克隆，為胰腺癌發(fā)病機制的探討、診斷和治療提供了許多新的靶點。其中，Survivin基因，作為凋亡抑制蛋白基因家族的成員之一，倍受關注。RNAi又叫轉錄后基因沉默。作為一門新的基因阻斷技術，近幾年來，RNAi在腫瘤基因治療方面的研究取得了重大進展。RNAi能用于胰腺癌的治療嗎?為

2、此，有必要作進一步的基礎研究。 [目的]1、探討胰腺癌細胞株PANC-1是否有SUIvivin表達。2、從胰腺癌細胞株PANC-1克隆survivin基因，并對其進行序列測定分析。3、針對survivin基因構建相應的干擾載體-shRNA表達載體。4、觀察并檢測干擾載體對胰腺癌細胞株PANC-I survivin表達的抑制情況，篩選出高效的干擾載體。5、檢測高效干擾載體是否可以誘導胰腺癌細胞株PANC-1凋亡，為以后運用RNAi

3、技術治療胰腺癌奠定一定的理論和實驗基礎。 [方法]1、本研究購買并傳代培養(yǎng)胰腺癌細胞PANC-1，分別采用RT-PER技術、免疫細胞化學方法、免疫熒光技術和WOStern-blot檢測胰腺癌細胞株PANC-1是否有survivin表達。2、用RT-PCR方法從胰腺癌細胞株PANC-1中調出survivin基因，并用T-A克隆方法把survivin基因克隆到T載體上，經過快速鑒定和酶切鑒定以后，送交公司進行序列測定分析。3、根據胰

4、腺癌細胞株PANC-1中調出的survivin基因序列設計并化學合成兩對干擾序列，其兩端帶有SalI、Xbal酶切位點，把干擾序列退火以后克隆到shRNA表達載體pTZU6+1的SalI、Xbal酶切位點上，并對構建的干擾載體進行酶切和測序鑒定。4、干擾載體轉染胰腺癌細胞株PANC-1，并用RT-PCR、免疫熒光技術、western-blot檢測干擾載體對胰腺癌細胞株PANC-1 survivin表達的抑制情況，從而篩選出高效的干擾載體

5、。5、把此高效的干擾載體轉染胰腺癌細胞株PANC-1，并用形態(tài)學方法、透射電鏡、DNA ladder、流式細胞儀等方法檢測干擾載體是否可以誘導胰腺癌細胞PANC-1凋亡。 ［結論］1、Survivin在胰腺癌細胞株PANC-1有較高表達，說明胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能有survivin的參與，并且其有可能成為胰腺癌的基因治療的一個靶點。2、用載體表達shRNA的方法可以抑制survivin的表達，其作用時要求序列互補，不能出現堿基錯