RNA干擾抑制胰腺癌細(xì)胞SURVIVIN表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、胰腺癌是一種惡性程度較高的腫瘤,其患病率在世界范圍呈上升趨勢(shì),預(yù)后極差。目前,隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,與胰腺癌有關(guān)的新的癌基因、抑癌基因和抗凋亡基因不斷被發(fā)現(xiàn)和克隆,為胰腺癌發(fā)病機(jī)制的探討、診斷和治療提供了許多新的靶點(diǎn)。其中,Survivin基因,作為凋亡抑制蛋白基因家族的成員之一,倍受關(guān)注。RNAi又叫轉(zhuǎn)錄后基因沉默。作為一門新的基因阻斷技術(shù),近幾年來(lái),RNAi在腫瘤基因治療方面的研究取得了重大進(jìn)展。RNAi能用于胰腺癌的治療嗎?為

2、此,有必要作進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。 [目的]1、探討胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1是否有SUIvivin表達(dá)。2、從胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1克隆survivin基因,并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定分析。3、針對(duì)survivin基因構(gòu)建相應(yīng)的干擾載體-shRNA表達(dá)載體。4、觀察并檢測(cè)干擾載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-I survivin表達(dá)的抑制情況,篩選出高效的干擾載體。5、檢測(cè)高效干擾載體是否可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1凋亡,為以后運(yùn)用RNAi

3、技術(shù)治療胰腺癌奠定一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法]1、本研究購(gòu)買并傳代培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞PANC-1,分別采用RT-PER技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)方法、免疫熒光技術(shù)和WOStern-blot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1是否有survivin表達(dá)。2、用RT-PCR方法從胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中調(diào)出survivin基因,并用T-A克隆方法把survivin基因克隆到T載體上,經(jīng)過(guò)快速鑒定和酶切鑒定以后,送交公司進(jìn)行序列測(cè)定分析。3、根據(jù)胰

4、腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中調(diào)出的survivin基因序列設(shè)計(jì)并化學(xué)合成兩對(duì)干擾序列,其兩端帶有SalI、Xbal酶切位點(diǎn),把干擾序列退火以后克隆到shRNA表達(dá)載體pTZU6+1的SalI、Xbal酶切位點(diǎn)上,并對(duì)構(gòu)建的干擾載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。4、干擾載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,并用RT-PCR、免疫熒光技術(shù)、western-blot檢測(cè)干擾載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 survivin表達(dá)的抑制情況,從而篩選出高效的干擾載體

5、。5、把此高效的干擾載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,并用形態(tài)學(xué)方法、透射電鏡、DNA ladder、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)干擾載體是否可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡。 [結(jié)論]1、Survivin在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1有較高表達(dá),說(shuō)明胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能有survivin的參與,并且其有可能成為胰腺癌的基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。2、用載體表達(dá)shRNA的方法可以抑制survivin的表達(dá),其作用時(shí)要求序列互補(bǔ),不能出現(xiàn)堿基錯(cuò)

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