RNA干擾技術(shù)聯(lián)合抑制胰腺癌細(xì)胞系中癌基因K-ras和AKT2表達的實驗性研究.pdf

1、胰腺癌由于其起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、解剖位置復(fù)雜、手術(shù)困難、對放化療不敏感等原因，已經(jīng)成為重要的致死性癌癥，尋找有效的基因治療方法是改善胰腺癌預(yù)后的重要措施之一。 本研究觀察RNA干擾(RNA interference，RNAi)同時抑制胰腺癌中兩個關(guān)鍵性癌基因K—ras和AKT2對于胰腺癌細(xì)胞系Panc—1細(xì)胞生長和凋亡的影響，探討其作用機制，為胰腺癌的臨床治療提供新的方法。本研究主要進行了以下幾方面的工作： 一、構(gòu)建并篩選

2、單干擾和雙干擾重組質(zhì)粒載體。 1.根據(jù)invitrogen公司提供的網(wǎng)上設(shè)計工具，設(shè)計了兩對針對K—ras的干擾序列；連接進入載體后，測序鑒定。 2.設(shè)計了四對針對AKT2的干擾序列；連接進入載體后，測序鑒定。 3.瞬時轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Panc—1細(xì)胞，篩選出有效的抑制K—ras或AKT2的重組質(zhì)粒載體。 4.采用限制性內(nèi)切酶方法構(gòu)建雙干擾重組質(zhì)粒載體。 二、重組質(zhì)粒載體降低相關(guān)癌基因mRNA和

3、蛋白的表達。 1.重組質(zhì)粒anti—kras可以有效和特異性地減少胰腺癌細(xì)胞系Panc—1細(xì)胞中K—rasmRNA和蛋白的水平。 2.重組質(zhì)粒anti—akt2可以有效和特異性地減少胰腺癌細(xì)胞系Panc—1細(xì)胞中AKT2mRNA和蛋白的水平。 3.重組質(zhì)粒anti—k+a和anti—a+k可以有效和特異性地減少胰腺癌細(xì)胞系Panc—1細(xì)胞中K—ras和AKT2mRNA和蛋白的水平。 三、重組質(zhì)粒減緩細(xì)胞生

4、長，促進細(xì)胞凋亡。 1.CCK—8方法檢測細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，相對于未處理組和陰性載體對照組，所有重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長均減慢，雙干擾重組質(zhì)粒組的生長受抑最顯著，與單干擾重組質(zhì)粒組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。 2.克隆形成試驗檢測細(xì)胞的生長增殖能力。結(jié)果顯示，相對于未處理組和陰性載體對照組，所有重組質(zhì)粒組的克隆形成能力均下降，雙干擾重組質(zhì)粒組的下降最顯著，與單干擾重組質(zhì)粒組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。 3.Heochst

5、方法檢測細(xì)胞凋亡時細(xì)胞核形態(tài)的改變。結(jié)果顯示，相對于未處理組和陰性載體對照組，所有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡小體，雙干擾重組質(zhì)粒組與單干擾質(zhì)粒組相比，凋亡小體數(shù)目增多顯著。 4.AnnexinV—FITC/PI法檢測細(xì)胞的早期凋亡。結(jié)果顯示，相對于未處理組和陰性載體對照組，所有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，雙干擾重組質(zhì)粒組凋亡細(xì)胞比例最高，與單干擾重組質(zhì)粒組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。 5.Caspase—3法檢測細(xì)胞的凋亡狀

6、態(tài)。結(jié)果顯示，相對于未處理組和陰性載體對照組，所有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡蛋白的激活，雙干擾重組質(zhì)粒組凋亡蛋白激活最顯著，與單干擾重組質(zhì)粒組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。 四、重組質(zhì)粒載體降低p—ERK和p—GSK激酶磷酸化水平，減少癌蛋白c—myc含量。 1.單干擾重組質(zhì)粒anti—kras轉(zhuǎn)染后可以有效降低信號通路RAS/MAPK中p—ERK激酶磷酸化水平。 2.單干擾重組質(zhì)粒anti—akt2轉(zhuǎn)染后可以有效降低信

7、號通路P13K/AKT中p—GSK激酶磷酸化水平。 3.雙干擾重組質(zhì)粒anti—k+a轉(zhuǎn)染后可以有效降低信號通路RAS/MAPK中p—ERK激酶磷酸化水平和P13K/AKT中p—GSK激酶磷酸化水平。 4.單干擾重組質(zhì)粒anti—kras、anti—akt2轉(zhuǎn)染后可以有效降低c—myc蛋白表達；雙干擾重組質(zhì)粒anti—k+a轉(zhuǎn)染后也可以明顯降低c—myc蛋白表達，與單干擾重組質(zhì)粒相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異。 五、重組質(zhì)

8、粒載體對動物體內(nèi)移植瘤生長的影響。 1.將各種重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未處理細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察其成瘤能力。結(jié)果顯示，與未處理組和陰性載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系相比，單干擾和雙干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系腫瘤生長緩慢，且雙干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞生長要慢于單干擾組。 2.預(yù)先在裸鼠背部皮下種植成瘤，采用PEI轉(zhuǎn)染方法，多點腫瘤內(nèi)注射兩次，觀察腫瘤的生長情況，結(jié)果顯示，與未處理組和單獨PEI轉(zhuǎn)染組相比，單干擾處理組腫瘤生長減緩，雙干擾

9、處理組腫瘤生長減緩更顯著，與單干擾組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。 本研究表明RNA干擾技術(shù)是一種十分有效的基因治療方法，聯(lián)合抑制原癌基因K—ras和AKT2可使胰腺癌細(xì)胞的生長代謝受到明顯的抑制、促進胰腺癌細(xì)胞的凋亡；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示聯(lián)合干擾可以有效抑制腫瘤細(xì)胞生長、使其喪失致瘤能力；聯(lián)合干擾發(fā)揮作用的可能機制是同時阻斷了兩條信號通路RAS/MAPK和P13K/AKT，誘導(dǎo)促凋亡蛋白BAD發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡作用以及促進c—myc蛋白的降解