肽核酸鉗制定量PCR法檢測(cè)K-ras基因突變的胰腺癌診斷應(yīng)用.pdf

1、胰腺癌是目前預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。胰腺癌早期癥狀不典型，缺乏簡(jiǎn)單、方便的檢查手段，特別是缺乏特異性腫瘤標(biāo)記物，是造成胰腺癌早期診斷困難的重要原因。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，基因診斷有望給胰腺癌的早期診斷帶來(lái)突破。近年來(lái)研究從胰腺穿刺活檢組織、胰液、十二指腸液和糞便等標(biāo)本中檢測(cè)到頻繁的K-ras基因突變，為胰腺癌的早期診斷提供了可能。但基因突變檢測(cè)方法限于傳統(tǒng)的基因表達(dá)、序列測(cè)定、突變和多態(tài)性分析等，只

2、適用于少數(shù)樣品的測(cè)定，操作步驟多且費(fèi)力，不便于自動(dòng)化。因此，本研究設(shè)計(jì)采用肽核酸(PNA)鉗制PCR實(shí)時(shí)定量技術(shù)檢測(cè)胰腺癌K-ras基因點(diǎn)突變，旨在探討K-ras、基因突變檢測(cè)對(duì)胰腺癌早期診斷的價(jià)值，建立適合臨床應(yīng)用的高效、簡(jiǎn)便、快捷的胰腺癌診斷方法。 我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了針對(duì)K-ras基因第12、13密碼子的肽核酸，在實(shí)時(shí)定量檢測(cè)中，肽核酸對(duì)野生型基因具有抑制作用。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立該方法并進(jìn)行條件優(yōu)化，包括DNA模板需要量、PN

3、A加入量及反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)條件等。并通過(guò)測(cè)序方法驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)，使用優(yōu)化后的方法對(duì)122例臨床血液標(biāo)本DNA進(jìn)行檢測(cè)。其中67例胰腺癌標(biāo)本中，突變率為59.7％(34/67)；慢性胰腺炎共22例，突變率為13.6％(3/22)；33例健康志愿者標(biāo)本無(wú)一例突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法簡(jiǎn)便，可同時(shí)檢測(cè)數(shù)十個(gè)樣本；敏感性高，可檢出的最小模板量為10<'3>拷貝，可檢出的突變/野生比例在10<'3>/10<'8>以上。該方法適用于輔助臨