BRAF突變肽核酸鉗制——PCR檢測法的建立.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年增加，并且先進的生物靶向治療主要針對復(fù)發(fā)患者。大腸癌術(shù)后治療計劃，美國FDA和我國明確指出，在一線和二線化療計劃的實施，加入靶向EGFR受體抗體靶向藥物（西妥昔單抗和帕尼單抗）時，需進行藥敏基因突變檢測。國際大樣本多中心研究表明，同時進行KRAS、BRAF突變檢測，并按此順序串聯(lián)診斷，可最大限度地準(zhǔn)確預(yù)測患者對于抗體靶向藥物的敏感性?，F(xiàn)有檢測方法主要有:經(jīng)典測序法、Taqman-ARMS、qPCR-HRM和Sc

2、orpion-ARMS。雖然DNA測序為國際公認(rèn)的分子檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但其靈敏度較低(10％)，有礙其臨床廣泛應(yīng)用。國外專利技術(shù)蝎形探針ARMS和對應(yīng)的TaqMan探針法，靈敏度高(0.1％)，主要用于各種類型的組織，包括操作，穿刺或內(nèi)窺鏡檢查組織，2小時即可完成檢測，試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認(rèn)可程度高，國內(nèi)已有試劑盒獲批CFDA。qPCR-HRM其靈敏度尚可(1％)，需要較高檔次的Q-PCR儀，多用于研究中，限制了其臨床應(yīng)用。肽核酸(Pe

3、ptide Nucleic Acid，PNA)是一種在結(jié)構(gòu)上與DNA有些許近似，但是在堿基組成上又有一點不同的核酸，其骨架由2-氨乙基甘氨酸代替DNA的磷酸二酯糖后形成了一種遠(yuǎn)比DNA穩(wěn)定的核酸。PNA十分穩(wěn)定，正確配對的DNA/PNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相應(yīng)的DNA/DNA，同時在PCR反應(yīng)過程中PNA不可作為Taq酶的底物，亦不會被其他酶所降解。對于錯配的PNA/DNA，哪怕只有一個堿基的錯配，也會造成其融解溫度下降9-10℃左右。目前

4、，肽核酸作為一種非常有用分子生物學(xué)工具已在疾病的診斷、治療等領(lǐng)域得到應(yīng)用。本課題擬在實驗室前期摸索出的肽核酸(PNA)壓制-PCR/KRAS突變檢測法的基礎(chǔ)上，將核心的PNA鉗制技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用于結(jié)直腸腫瘤組織中BRAF突變的檢測，有效抑制樣本在PCR反應(yīng)中BRAF野生型基因的擴增，從而提高突變基因的檢測靈敏度以及降低檢測下限。
　　目的：探索肽核酸(PNA)抑制-PCR/BRAF突變檢測法的診斷界值及其檢測下限。
　　方法：將

5、含BRAF突變的質(zhì)粒/細(xì)胞株DNA和BRAF野生型組織DNA以不同比例（突變/總體:50％，25％，12.5％，6.25％，3.1％，1.6％，0.8％，0.4％，0）混合配制成參考品，獨立配制10個批次并分別進行PNA-PCR/BRAF突變檢測，整理出BRAF突變CT值及其總體CT值，并計算ACT值（突變CT值-總體CT值），運用ROC曲線擬合的ACT作為判明BRAF基因突變的最佳診斷界值(Cut-off值)，并根據(jù)前者得出對應(yīng)的檢測

6、下限。
　　結(jié)果：陽性參考品在不同突變百分率下的突變CT值、ACT值與陰性參考品相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，總體CT值與陰性參考品相比無差異。COLO205細(xì)胞株ROC曲線的曲線下面積(AUC)是0.9，Cut-off值是11.8，敏感度和特異度分別為78.6％和100％，檢測下限為3.1％; M1質(zhì)粒ROC曲線的AUC是0.974，Cut-off值是12，敏感度和特異度分別達到92.9％和100％，檢測下限為1.6％; M