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文檔簡介
1、目的:
采用HRM技術(shù)建立一種快速、簡便檢測BRAF基因T1799A突變的實驗方法,并應(yīng)用于甲狀腺腫瘤的檢測,初步探討其臨床應(yīng)用價值。
方法:
1.根據(jù)已知的BRAF基因T1799A突變的位點信息,用Primer Premier5.0軟件設(shè)計定點突變特異性引物,采用高保真PCR擴增含有野生型突變基因的片段,并通過定點突變方法獲取突變型基因片段。同時采用TA克隆技術(shù)獲得野生型和純合突變型的質(zhì)粒載體用于HRM檢
2、測體系的模板和基因分型對照。
2.通過優(yōu)化反應(yīng)體系建立HRM技術(shù)檢測BRAF基因T1799A突變的方法,并進行方法學(xué)評價。
3.收集176例臨床甲狀腺腫瘤患者組織標(biāo)本,采用HRM技術(shù)檢測BRAF基因T1799A突變,并與雙向基因測序結(jié)果比對,探討其初步的臨床應(yīng)用價值。
結(jié)果:
1.以正常人基因組DNA為模板,采用定點突變后成功引入BRAF基因中T-1799-A的基因突變,經(jīng)測序比對驗證分析,獲得含
3、有野生型BRAF基因T1799A突變片段和純合突變型BRAF基因T1799A突變片段的質(zhì)粒。
2.用分別含BRAF基因T1799A突變野生型與純合突變型基因片段的質(zhì)粒DNA作為HRM檢測體系的模板與基因分型對照,通過體系優(yōu)化建立了快速、簡便的BRAF基因T1799A突變的HRM檢測方法;批內(nèi)、批間的重復(fù)性實驗結(jié)果表明,野生型、雜合型、純合突變型的Tm值和Ct值的變異系數(shù)均小于5%;該檢測體系可以對濃度范圍1pg到100ng的D
4、NA模板進行基因分型;檢測突變雜合比例能力的結(jié)果顯示可以檢測出不低于25%的突變。
3.176例甲狀腺腫瘤患者組織標(biāo)本進行BRAF基因T1799A突變檢測,結(jié)果顯示甲狀腺惡性腫瘤組檢出57.3%的突變率,對照組甲狀腺良性病變中均無此突變,與測序所得基因型結(jié)果完全相符;兩組基因突變率比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。
結(jié)論:
1.采用定點突變的方法和TA克隆技術(shù)成功克隆了含有BRAF基因T1799A突變片
5、段的野生型與純合突變型質(zhì)粒,為后續(xù)HRM技術(shù)檢測該基因突變的方法提供了模板與基因分型對照。
2.利用HRM分析技術(shù),建立了一種快速、簡便、靈敏、特異的適用臨床檢測BRAF基因T1799A突變的方法,為該突變相關(guān)的臨床疾病的診斷、治療等提供可選擇的實驗室工具。
3.BRAF基因T1799A突變檢測結(jié)果顯示該突變與甲狀腺惡性腫瘤有相關(guān)性,可作為今后甲狀腺腫瘤的臨床診斷指標(biāo)。該HRM技術(shù)檢測BRAF基因T1799A突變的方
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