早期非小細(xì)胞肺癌EGFR-KRAS-BRAF突變的初步臨床研究.pdf

1、背景：
　　肺癌每年大約對全球的1.2億人口造成影響，并成為世界范圍內(nèi)，惡性腫瘤致死的首要原因。在所有肺癌類型中，總數(shù)的80％為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其具體類型包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等，與小細(xì)胞肺癌相比較，非小細(xì)胞肺癌增值及擴散的速度相對較慢，主要轉(zhuǎn)移及擴散方式為淋巴轉(zhuǎn)移、血運轉(zhuǎn)移及直接浸潤生長等，因非小細(xì)胞肺癌相對小細(xì)胞肺癌進展速度較慢，因此，其進一步治療存在可能性。根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南，TMN分期為

2、Ⅲa期以前的非小細(xì)胞肺癌首選手術(shù)治療。然而，根據(jù)相關(guān)文獻報導(dǎo)，非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后長期生存情況并不樂觀，對于Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb期非小細(xì)胞肺癌患者，其術(shù)后的5年生存率分別為80％、60％、55％、40％，而對于已出現(xiàn)對側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)后5年生存率則降至13％。過去數(shù)十年間，對于Ⅲa期以后及分期在Ⅲa期以前、Ⅰb期以后，已行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者，系統(tǒng)性治療主要是建立在以鉑類為基礎(chǔ)的全身化療，但是，約有20％的病人會出現(xiàn)諸如惡

3、心、嘔吐等化療反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且僅有少部分患者能在全身化療中獲益。然而，對于未接受正規(guī)系統(tǒng)治療的非小細(xì)胞肺癌患者，只有4-5個月的中位生存期，一年生存率約為10％。因此，尋求對非小細(xì)胞肺癌患者最行之有效的治療方式，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后，成為當(dāng)前針對非小細(xì)胞肺癌的研究熱點。
　　近年來，細(xì)胞表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的發(fā)現(xiàn)，使非小細(xì)胞肺癌的系

4、統(tǒng)治療邁進了一個全新的階段。以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosinekinase inhibitors，EGFR-TKI)為基礎(chǔ)的靶向藥物的治療使得非小細(xì)胞肺癌的系統(tǒng)治療逐步向個體化治療轉(zhuǎn)變。EGFR-TKI的作用機制為競爭性結(jié)合EGFR，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并促進腫瘤細(xì)胞的凋亡。相比傳統(tǒng)化療藥物，靶向藥物具有生物利用度高，選擇性強，不良反應(yīng)輕微等特點

5、。然而，并非所有的非小細(xì)胞肺癌患者均適合EGFR-TKI治療，大量臨床研究表明，亞裔無吸煙史的女性腺癌患者為TKI的優(yōu)勢人群，而在優(yōu)勢人群中，僅外顯子19或21位突變的患者對該類藥物敏感，且部分患者在服用該類藥物后，除出現(xiàn)皮疹、腹瀉等不良反應(yīng)外，更會出現(xiàn)對TKI耐藥，對患者的后續(xù)治療和生存情況造成巨大影響，因此TKI的耐藥問題仍是目前臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究急需解決的問題。在現(xiàn)階段的研究中，研究這發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕

6、霉素靶蛋白(phosphotylinosital3 kinase/protein kinase B/the mammaliantarget of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞生存和凋亡中發(fā)揮著重要作用。初步研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活是EGFR-TKI類藥物耐藥的原因之一。除了這一通路外，近年研究發(fā)現(xiàn)，EGFR下游通路Ras-Raf-MEK-ERK的激活也被認(rèn)為是TKI耐藥

7、的重要原因，但其具體機制尚未闡明，因此，我們設(shè)計了該臨床研究，以期對Ras-Raf-MEK-ERK通路進行初步探索。
　　目的：
　　本實驗通過收集Ⅰa-Ⅲa期，已行根治性手術(shù)治療的患者的術(shù)后組織標(biāo)本，包括腫瘤組織、肺組織及術(shù)中清掃的淋巴結(jié)，通過對非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中EGFR基因各基因位點、Kras基因及Braf基因等各個基因的突變情況的統(tǒng)計分析，結(jié)合文獻復(fù)習(xí)，對Kras基因、Braf基因與EGFR基因之間的關(guān)系進行初步探

8、尋，為進一步研究Ras-Raf-MEK-ERK通路導(dǎo)致EGFR-TKI耐藥的具體機制奠定基礎(chǔ)，并指導(dǎo)臨床TKI治療。
　　方法：
　　1、材料:
　　選取2011-2013年間，在解放軍海軍總醫(yī)院及301醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的患者共計74例，術(shù)后經(jīng)病理均確診為非小細(xì)胞肺癌，術(shù)后或術(shù)前未經(jīng)過放化療或靶向藥物治療，且無其他系統(tǒng)腫瘤病史，根據(jù)UICC指南，TNM分期為Ⅰa-Ⅲa期以前非小細(xì)胞肺癌患者，分別記錄性別、年齡、吸煙史、腫

9、瘤類型、腫瘤分化程度、腫瘤的TNM分期，腫瘤大小及侵犯程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床資料信息。
　　獲取新鮮手術(shù)標(biāo)本，包括瘤體、切除肺葉以及已清掃淋巴結(jié)，用中性福爾馬林固定16h-24h。其中肺葉標(biāo)本及術(shù)中清掃淋巴結(jié)標(biāo)本只作為分期依據(jù)，不行進一步基因檢測分析。
　　2、檢測方法:
　　2.1 基因突變的檢測(xTAG-液相芯片技術(shù)):①使用Maxwell系統(tǒng)對FFPE切片中基因組DNA進行提取純化。②PCR預(yù)擴增:以純化后

10、的DNA作為模板，進行PCR預(yù)擴增，在一定條件下，進行酶切反應(yīng)和ASPE反應(yīng)。③雜交檢測:在反應(yīng)管中加入PCR產(chǎn)物、微球混合液和雜交液，在95℃條件下反應(yīng)5min，將混合液放入60℃恒溫箱，雜交15min。向混合液中加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，在60℃恒溫條件下反應(yīng)5min。④于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)并進行分析，熒光值≤100判斷為野生型，＞200判斷為突變型。
　　2.2 基因突變水平檢測應(yīng)用分支DNA-液相芯片技術(shù)，檢測

11、手術(shù)切除的腫瘤組織中EGFR基因各個位點、Kras基因以及Braf基因的突變情況，具體步驟如下:①將福爾馬林固定后石蠟包埋的腫瘤組織(FFPE)樣本取出，在其中加入適量裂解液后，置于55℃恒溫箱內(nèi)，在此條件下進行裂解反應(yīng)2 h;②預(yù)雜交:在孵育板上加入適量已裂解完成的樣品液，依次將支持探針一微球、支持延伸探針及緩沖液加入樣品液，置于55℃恒溫箱內(nèi)，震蕩儀震蕩樣液，孵育18-24小時;⑨吸取上清:翌日，將樣本液及孵育板取出，在磁力架上放置

12、2 min，此時磁性微球應(yīng)向孵育板底部聚集，待磁性微球在底部聚集完成后，吸取上清液，棄置;④洗滌:將洗滌液加入已棄去上清的孵育板中，置于震蕩儀洗滌2 min，再次將孵育板置于磁力架上2min，吸取上清液，棄置;重復(fù)以上步驟3次;⑤雜交:在樣本液中加入擴增延展探針及標(biāo)記探針，置入55℃恒溫箱，震蕩1h;⑥洗滌:孵育板放在磁力架上2 min，吸取上清，棄置;重復(fù)洗滌2次;⑦信號增強:加入鏈霉親和素結(jié)合的藻紅蛋白，置入50℃恒溫箱中，震蕩儀3

13、0 min;⑧洗滌:取已增強信號的孵育板，置于磁力架上2 min，吸取樣本液上清，棄置;重復(fù)洗滌2次;⑨讀取數(shù)據(jù):再次將洗滌液加入孵育板，震蕩5 min，置于Luminex閱讀儀上，完成數(shù)據(jù)讀取;⑩分析:數(shù)據(jù)分析，得出檢測結(jié)果。
　　3、統(tǒng)計學(xué)方法
　　EGFR各基因位點、Kras基因、Braf基因的突變情況與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤類型、腫瘤的TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小及侵犯程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異性分析采用x

14、2檢驗，EGFR各基因位點與Kras基因、Braf基因間突變的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)，所有統(tǒng)計學(xué)分析由SPSS13.0完成，p＜0.01認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)檢測，在74名非小細(xì)胞肺癌患者中，EGFR exon18突變率為1.35％(1/74)，EGFR exon19突變率為25.68％(19/74)，EGFR exon20突變率為0％(0/74)，EGFR exon21突變率為20.27

15、％(15/74)，Kras基因突變率為25.68％(19/74)，Braf基因的突變率為6.76％(5/74)。其中EGFR、Kras、Braf等基因突變在不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤分化程度、腫瘤的TNM分期，腫瘤大小及侵犯程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者中無差異性，而在不同病理類型患者中存在差異性，腺癌患者突變率較高，非腺癌患者突變率低。
　　2、經(jīng)過統(tǒng)計分析，EGFR基因的E19、E21位點突變與Kras基因突變存在負(fù)相關(guān)（相關(guān)系

16、數(shù)r分別為-0.345和-0.309，p＜0.01），但關(guān)系不密切(r＜0.5)、EGFR基因的E18、E19、E21位點與Braf（相關(guān)系數(shù)r分別為-0.032，-0.158，-0.011，p＞0.1）不存在相關(guān)性、Kras與Braf之間不存在相關(guān)性(r=-0.158，p=0.178)。
　　結(jié)論：
　　1、EGFR基因各位點的突變、在不同病理類型的患者中存在差異，其中，EGFR在腺癌患者中的突變率高于非腺癌患者，而其他臨

17、床資料中午差異。Kras基因以及Braf基因的突變情況在不同的臨床資料中無差異。
　　2、EGFR基因突變與Kras突變呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不大，和Braf基因突變不相關(guān)，Kras基因與Braf基因突變不存在相關(guān)性，提示EGFR、Kras和Braf等基因的突變?yōu)橄嗷オ毩⒌倪^程。
　　3、對于非小細(xì)胞肺癌患者，手術(shù)切除后，確診分期為Ⅰa-Ⅲa期，及早對患者標(biāo)本進行基因檢測，對臨床上術(shù)后TKI的靶向治療具有重要的指導(dǎo)意義，同時可以