猴泡沫病毒(SFV)檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、猴泡沫病毒（Simian Foamy Virus,SFV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，泡沫反轉(zhuǎn)錄病毒亞科，是一種類似于猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）的反轉(zhuǎn)錄病毒。SFV雖然不會(huì)對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物致病，但在物種間的傳播會(huì)引起致病性的改變，猴作為一種重要的模式動(dòng)物，應(yīng)用于多種疾病模型，也用于相關(guān)生物制品的生產(chǎn)，因此，進(jìn)一步完善對(duì)實(shí)驗(yàn)猴群的質(zhì)量監(jiān)控迫在眉睫。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測(cè)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中，猴泡沫病毒是清潔級(jí)

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體。目前，多用全病毒包被ELISA法及PCR法檢測(cè)SFV感染狀況?，F(xiàn)有檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍有限，程序較為復(fù)雜。
　　本課題嘗試從兩個(gè)方面建立 SFV的檢測(cè)方法，一是從分子生物學(xué)方面，建立SFV核酸的PCR檢測(cè)方法及熒光定量PCR方法；二是從血清學(xué)方面，合成重組蛋白代替SFV抗原來(lái)檢測(cè)血清中的SFV抗體，并建立猴泡沫病毒的間接免疫熒光檢測(cè)法。同時(shí)，將所建立的檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)用猴及相關(guān)生物制品的檢測(cè)，以驗(yàn)證其開(kāi)展實(shí)

3、際應(yīng)用的價(jià)值。
　　根據(jù)NCBI上發(fā)表的SFV-1的基因組序列，將其與小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等反轉(zhuǎn)錄病毒科病毒的基因組進(jìn)行比對(duì)，找出差異序列，設(shè)計(jì)引物。篩選到四組引物，其中PCR引物一組，RT-nestPCR引物三組。為驗(yàn)證引物的特異性，設(shè)立了小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、麻疹腮腺炎病毒和正常BHK-21細(xì)胞等多個(gè)對(duì)照。只有SFV有特定大小的目的條帶出現(xiàn)，特異性較好。對(duì)四組

4、引物進(jìn)行靈敏度比較，有一組RT-nestPCR引物靈敏度最高，可檢測(cè)到的最小病毒滴度為106.3TCID50，可檢測(cè)到的最小核酸濃度為0.26pg/μL。
　　以定量的10倍系列稀釋的質(zhì)粒pGEM-T Easy-SFVpol為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了檢測(cè)SFV的熒光定量PCR方法。用建立的檢測(cè)方法對(duì)猴外周血淋巴細(xì)胞及脊髓灰質(zhì)炎疫苗進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī) PCR檢測(cè)方法作比較。結(jié)果顯示，所建立的方法靈敏度可達(dá)4705拷貝/μ

5、L，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度高100倍，而與小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）沒(méi)有交叉反應(yīng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合于對(duì)猴群及相關(guān)生物制品的SFV進(jìn)行批量檢測(cè)。
　　用大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)了gag蛋白C末端的193個(gè)氨基酸，該區(qū)域?yàn)槊庖邇?yōu)勢(shì)表位，有較強(qiáng)的診斷潛能。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，并用蛋白印跡法檢驗(yàn)其抗原性，與SFV抗體陽(yáng)性的小鼠血清及猴血清有明顯反應(yīng)，與MuLV抗體陽(yáng)性的小

6、鼠血清無(wú)明顯反應(yīng)，說(shuō)明所表達(dá)抗原特異性良好。用方陣滴定法確定抗原的最適工作條件為：包被抗原濃度5μg/ml，BHK-21細(xì)胞正抗稀釋度1：20000，血清稀釋度1：80，羊抗人二抗稀釋度1：30000。評(píng)價(jià)猴泡沫病毒重組抗原ELISA檢測(cè)方法的精密度及重復(fù)性，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)用猴的檢測(cè)。
　　為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用猴群中 SFV的感染情況，建立了針對(duì)猴血清的間接免疫熒光方法（IFA）。用SFV病毒BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)的方法制備抗原，通過(guò)濃度梯度

7、滴定，分別確定了一抗猴血清的最佳工作濃度為1:10，二抗FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體的最佳工作濃度為1:100。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以對(duì)猴血清抗體水平進(jìn)行半定量分析。
　　所建立的PCR方法可以作為SFV感染的確證方法，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SFV國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，該方法準(zhǔn)確性好，檢測(cè)效率高，可用于猴泡沫病毒的定量檢測(cè)，為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物猴泡沫病毒的感染狀況提供了依據(jù)。在國(guó)內(nèi)首次建立了猴泡沫病毒的重組抗原ELISA檢測(cè)方法，為SFV檢測(cè)標(biāo)