猴腺病毒檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、猴腺病毒（Simian Adenovirus,SAdV）屬于哺乳動(dòng)物腺病毒屬，與人腺病毒親緣關(guān)系很近，曾在生產(chǎn)用猴腎細(xì)胞和脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗檢定中分離出一些SAdV毒株[1、2]。SAdV在實(shí)驗(yàn)猴群中高度流行，并存在變種傳染給人的風(fēng)險(xiǎn)[3、4、17]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于 SAdV感染流行情況的研究很少，現(xiàn)有檢測(cè)方法如病毒分離培養(yǎng)和用人腺病毒抗原 ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，周期長(zhǎng)程序復(fù)雜、特異性差。
　　本實(shí)驗(yàn)嘗試從兩個(gè)方面建立 SAdV

2、的檢測(cè)方法，一是從分子生物學(xué)方面，建立針對(duì)SAdV核酸的PCR和熒光定量 PCR檢測(cè)方法；二是從血清學(xué)方面，利用表達(dá)的重組蛋白和純化的SAdV抗原，建立針對(duì)SAdV-1抗體的檢測(cè)方法，并建立 SAdV-1的間接免疫熒光檢測(cè)法。同時(shí)，將所建立的檢測(cè)方法初步應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)猴群及相關(guān)生物制品中 SAdV的檢測(cè)。
　　通過(guò)多序列比對(duì)分析已報(bào)道的不同亞屬 SAdV和鼠腺病毒（MAD）、犬腺病毒(ICH)、禽腺病毒(CELO)基因組序列，選擇 S

3、AdV保守性高且與 MAD、ICH、CELO序列有差異區(qū)域作為靶序列，針對(duì)該區(qū)域用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。經(jīng)過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化和特異性和敏感性驗(yàn)證，成功篩選出一對(duì)特異性好、靈敏度高的引物，目的條帶大小為328bp，建立了SAdV的PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，本方法只需一步 PCR就可以將 SAdV與 MAD、ICH、CELO區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且能檢出不同亞屬的猴腺病毒（SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20）。所

4、能檢測(cè)到的最小 DNA模板濃度為47.9pg/mL,比文獻(xiàn)報(bào)道的引物[5]靈敏度提高100倍。
　　用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)實(shí)驗(yàn)猴群中 SAdV感染情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SAdV高度流行（陽(yáng)性率49.2％），主要屬于 G亞屬和另一新發(fā)現(xiàn)的以SAdV-49為代表的分支。食蟹猴感染率高于恒河猴，并從廣東地區(qū)食蟹猴陽(yáng)性樣本中成功分離出一株 SAdV。經(jīng)電鏡和全基因組測(cè)序鑒定，發(fā)現(xiàn)該分離株基因組全長(zhǎng)為3,3676bp與 G亞屬的SA

5、dV-1同源性最高為96%。主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體氨基酸存在變異。六鄰體相關(guān)蛋白前體 pVⅠ有300bp編碼核苷酸缺失。
　　找出 G亞屬 SAdVpol基因共有保守區(qū)域并設(shè)計(jì)探針引物，制備質(zhì)粒 pGEM-T Easy-SAdVpol標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立了G亞屬 SAdV特異的熒光定量PCR檢測(cè)方法。相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)差等參數(shù)均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)，建立的熒光定量 PCR檢測(cè)方法定量準(zhǔn)確、有效。經(jīng)過(guò)特異性、敏感性方法學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)建立

6、的熒光定量 PCR檢測(cè)方法具有很好的G亞屬特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)6拷貝/μL，靈敏度比常規(guī) PCR方法高10倍，能對(duì)SAdV拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量。用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)猴群及脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī) PCR檢測(cè)方法作了比較，發(fā)現(xiàn)常規(guī) PCR檢測(cè)為弱陽(yáng)性的樣本，熒光定量 PCR均能準(zhǔn)確定量拷貝數(shù)。
　　目前腺病毒的研究主要集中在人腺病毒，而對(duì)于猴腺病毒六鄰體（hexon） Loop1、Loop2區(qū)和五鄰體的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)

7、建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SAdV L1、pET30a-SAdV L1-L2、pET30a-SAdV P3，用大腸桿菌 BL21(DE3)表達(dá)了hexon蛋白的L1區(qū)和L1-L2區(qū)和五鄰體單體 P3，與預(yù)期大小相符，經(jīng)脫鹽，鎳親和柱純化處理，獲得了高純度的目的蛋白。用Western Blot對(duì)3種重組蛋白抗原性進(jìn)行了初步活性鑒定，其中重組蛋白 L1抗原性較好，但與血清中SAdV-1天然抗體的親和力仍較差。SAdV重組抗原 ELISA檢

8、測(cè)方法還需后續(xù)進(jìn)一步詳細(xì)研究。
　　采用純化的BSC-1細(xì)胞培養(yǎng)的SAdV-1抗原，建立 SAdV-1抗體的ELISA檢測(cè)方法。用方陣滴定法確定最適工作條件：包被抗原濃度2.5μg/ml，BSC-1細(xì)胞作為正?？乖瓕?duì)照，稀釋度1：400（0.52μg/ml），血清稀釋度1：100，羊抗猴 IgG酶標(biāo)記抗體稀釋度1：20000。SAdV-1抗體 ELISA檢測(cè)方法經(jīng)特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)，初步應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)用猴 SAdV-1抗體

9、的檢測(cè)。
　　建立了SAdV-1抗體檢測(cè)的間接免疫熒光方法（IFA）。用BSC-1細(xì)胞培養(yǎng)的方法制備抗原，通過(guò)濃度梯度滴定，待檢猴血清的最佳工作濃度為1:10，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗猴 IgG抗體的最佳工作濃度為1:250。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以對(duì)猴血清SAdV-1抗體水平進(jìn)行半定量分析。
　　建立的PCR方法經(jīng)過(guò)應(yīng)用驗(yàn)證具有很好的準(zhǔn)確性，能檢出不同亞屬的SAdV，是較好的SAdV感染的確證方法。利用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè) SAdV