登革病毒血清抗體分型方法的建立與初步應用.pdf

1、目的:
　　登革病毒(Dengue virus，DENV)包膜蛋白第Ⅲ結構域(Envelope domainⅢ，EDⅢ)介導病毒吸附感染受體細胞，并刺激機體產(chǎn)生針對DENV的型特異性抗體。二次異型DENV感染時，由于抗體依賴感染增強作用(Antibody dependent enhancement，ADE)，體內(nèi)存在的登革病毒抗體會導致感染增強并誘發(fā)重癥登革熱(Severe dengue fever，SD)。通過檢測登革熱(Den

2、gue fever，DF)患者體內(nèi)已存在的抗體型別，結合本次感染的病毒型別，判斷是否發(fā)生二次異型感染，可用于評估患者發(fā)展為重癥登革熱的風險。目前，登革病毒血清抗體分型可以通過蝕斑減少中和實驗(Plaque reductionneutralization test，PRNT)實現(xiàn)，但由于PRNT技術操作繁雜且耗時，主要局限在科研中應用。因此臨床急需建立一種能簡單、快速對登革病毒血清型特異性抗體分型的新技術。本研究擬通過原核基因工程技術獲得

3、登革病毒EDⅢ重組蛋白，建立ELISA檢測方法對登革病毒血清特異性抗體分型，并初步評價該方法的診斷效果。為今后應用于臨床DF患者病情的評估，預測重癥登革熱的發(fā)病風險以及對登革熱流行地區(qū)進行流行病學調(diào)查提供技術支撐。
　　方法:
　　1.利用PCR技術分別擴增登革1型和2型病毒EDⅢ基因，構建原核基因表達載體pET28b-EDⅢ，轉化BL21后經(jīng)IPTG誘導表達，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(MALDI-TOF-M

4、S)鑒定重組蛋白，采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白。
　　2.利用高碘酸鈉法對登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白進行辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記，經(jīng)凝膠過濾層析純化酶標記蛋白。
　　3.建立登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測的雙抗原夾心ELISA法，對抗原包被濃度、酶標抗原濃度、標本稀釋度以及顯色時間等條件進行優(yōu)化。
　　4.利用自建的分型ELISA法檢測登革熱患者恢復期血清

5、標本，與登革病毒IgG抗體檢測試劑盒和PRNT方法的檢測結果進行比較，評估登革1型和2型病毒血清抗體分型ELISA方法檢測性能。
　　成果:
　　1.成功誘導表達登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白，兩種重組蛋白均主要以包涵體蛋白形式表達;MALDI-TOF-MS鑒定結果顯示兩種重組蛋白分別是登革1型和2型病毒EDⅢ蛋白;采用鎳親和層析技術獲得高純度的重組蛋白。
　　2.利用高碘酸鈉法獲得酶標記蛋白EDⅢ-HRP，并通過凝

6、膠過濾層析法成功純化了酶標記蛋白EDⅢ-HRP。
　　3.建立了登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測的雙抗原夾心ELISA法，方法條件優(yōu)化結果顯示最佳抗原包被濃度和酶標抗原濃度均為1μ g/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，最佳顯色時間為20min。
　　4.48例登革1型病毒感染患者恢復期血清標本，登革病毒IgG ELISA檢測試劑盒和自建1型IgG ELISA檢測陽性率均為83.3％(40/48)，低于PRNT的陽性率(95

7、.8％);自建1型IgG ELISA和PRNT之間存在相關性，相關系數(shù)R2為0.4590，P＜0.01。11例登革2型病毒感染患者恢復期血清標本，自建2型IgG ELISA檢測的陽性率為81.8％(9/11)，高于登革病毒IgG檢測ELISA試劑盒陽性率(45.5％)。自建1型IgG ELISA和2型病毒感染患者血清之間的交叉反應為22.9％(11/48)，自建2型IgG ELISA和1型病毒感染患者血清之間的交叉反應為45.5％(5/