丙型肝炎病毒血清學分型方法的建立及初步臨床評價.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,目前全球約有1.8億人(占全球人口的3％)感染HCV,其中1.3億人為慢性HCV攜帶者。根據(jù)1992~1995年第二次病毒性肝炎血清學流行病調查結果顯示,我國人群抗-HCV的陽性率平均為3.2%,屬于中度流行。丙型肝炎易發(fā)展成慢性,約75%~85%急性肝炎可發(fā)展成慢性肝炎甚至肝硬化和肝癌。感染丙型肝炎病毒的病人在20~30年內肝硬化發(fā)生率為10~25%,HCV引發(fā)的肝硬化病人10年后肝功能失代償發(fā)生率為30%,肝癌年

2、發(fā)生率為1%~3%,給我國的公共衛(wèi)生事業(yè)帶來極大的危害。
　　HCV為單股正鏈RNA病毒,屬黃病毒科,于1989年首次克隆成功,基因組全長約9.5kb,含有一個約9033個核苷酸構成的開放讀碼框,編碼結構蛋白和非結構蛋白。結構蛋白包括核心蛋白(C),包膜蛋白gp33(E1)、gp70(E2),非結構蛋白有p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等。由于RNA酶缺少校對功能,整個基因組呈現(xiàn)高度的變異性,目前HCV

3、至少分為6個基因型和80多種以上的亞型。在我國,主要的基因型為1b,其次為2a,還有其它少見型別。
　　根據(jù)我國《丙型肝炎防治指南》,慢性丙型肝炎標準治療方案是以聚乙二醇化干擾素α和利巴韋林為主的聯(lián)合治療。其中,基因型是聯(lián)合治療方案的一個重要基線預測指標,對臨床用藥的劑量和時間具有重要指導意義。目前常用的基因分型主要方法包括特異性引物擴增后直接測序分析、限制性片段長度酶切多肽性(RFLP)分析、特異性探針PCR法及基因芯片法等,盡

4、管方法的特異性和靈敏度很高,但由于基因分型方法需要HCVRNA提取等過程,操作復雜,技術要求高,一般實驗室難以開展,而且當HCV-RNA陰性或由于保存不當及處理過程中HCV-RNA遭到破壞時,則不能進行基因分型。為此,學者提出了HCV血清學分型,即在HCV基因型特異性抗原表位篩選的基礎上,采用血清學技術,根據(jù)患者體內型特異性抗體的存在情況,進行血清學分型。
　　目前國際上商品化的HCV血清分型試劑主要有3種,分別是Murex HC

5、V1-6型、Chiron RIBA1-3型和日本HCV1、2血清分型試劑盒。其中美國Abbott公司的Murex HCV1-6型血清分型試劑是根據(jù)HCV-NS4區(qū)基因片段合成1-6型的型特異性多肽,采用抗原競爭免疫酶聯(lián)法,鑒定與基因型相對應的不同血清型。由于受到不同國家地區(qū)及標本選擇的影響,該試劑臨床評價結果不盡相同,分型率大致為60%~80%,與基因分型的符合率為90%~97%;Chiron公司研制生產的RIBA HCV血清分型試紙條

6、采用免疫膠體金技術,根據(jù)NS4區(qū)型特異性表位多肽為主,Core區(qū)型特異性表位多肽為輔進行血清學分型,其分型率能達到80%以上,特異性在90%~96%;另外日本國際試藥株式會社的HCVGr分型試劑盒是根據(jù)NS4區(qū)型特異性的抗原肽建立的血清分型試劑,僅能鑒定1、2型,分型率為89.6%,特異性為96.0%。但這些商品化的血清分型試劑在我國尚未注冊,且價格昂貴,難于獲得,因此,本課題旨在研究建立針對我國主要流行基因型對應血清型的分型方法,填補

7、國內空白。
　　本課題根據(jù)文獻報道,從HCV databases數(shù)據(jù)庫(http://hcv.lanl.gov/content/index)下載丙型肝炎病毒NS4區(qū)的氨基酸序列,通過Biosun生物信息學軟件對HCV-NS4區(qū)序列的抗原表位進行預測分析,確定HCV-NS4區(qū)抗原表位主要位于1693~1708aa,C區(qū)型別特異性抗原表位位于67~81aa,并通過HCV databases數(shù)據(jù)庫在線進行同源性比對分析,最后確定NS4區(qū)

8、I型氨基酸序列為AIIPDREVLYQEFDEM,Ⅱ型氨基酸序列為VVAPDKEVLYEAFDEM,C區(qū)I型氨基酸序列為KARRPEGRTWAQPGY,Ⅱ型氨基酸序列為KDRRTTGKSWGRPGY。根據(jù)確定的型別特異性氨基酸序列,采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子推斷出其對應的核苷酸序列,通過重疊延伸PCR技術合成C-I、C-Ⅱ、NS4-I、NS4-Ⅱ、C+NS4-I型嵌合及C+NS4-Ⅱ型嵌合基因,酶切后插入PGEX-4T-2載體中,構建出6株

9、高效表達質粒,并采用GST瓊脂糖凝膠FF柱進行純化,獲得了6個純度均為95%以上的抗原。
　　通過間接ELISA方法,采用50例抗-HCV抗體陽性的基因分型血清對6個抗原的抗原活性進行初步檢測,結果顯示:獲得的3個I型抗原C-I、NS4-I及C+NS4-I嵌合與HCV-1b型血清的反應性分別為25.71%、74.28%、88.57%,與HCV-2a型血清之間的交叉反應性分別為20.00%、40.00%、66.67%,I型抗原與1b

10、血清之間的反應性均高于與2a血清的反應性,表現(xiàn)出I型抗原特有的型別特異性;獲得的3個II型抗原C-Ⅱ、NS4-Ⅱ、及C+NS4-Ⅱ嵌合與2a型血清的反應性分別為33.33%、66.67%、73.33%,與1b型血清的交叉反應性分別為11.42%、48.57%、28.57%,獲得的II型抗原與2a型血清的反應性顯著高于1b型,表現(xiàn)出II型抗原特有的型別特異性。
　　為了消除型別特異性抗原與I、Ⅱ型血清之間交叉反應性,本研究采用競爭免

11、疫酶聯(lián)法,并通過20組不同的實驗進行HCV血清分型檢測方法的系統(tǒng)優(yōu)化,最終確定HCV血清分型檢測方法的工藝條件為:PH9.6碳酸鹽緩沖液作為包被液;20%山羊血清-0.01MPBSPH7.4為封閉液;LD5-HRP作為酶結合物(LD5是一種新的、具有更廣泛IgG結合特性的分子);確定競爭抗原的濃度為1.5μg/μl;競爭抗原稀釋液為山羊血清(5%)、酪蛋白(0.5%)-0.01MPBSPH7.4;4個NS4-I、C-I、NS4-Ⅱ及C-

12、Ⅱ型分片段抗原作為包被抗原,2個I、Ⅱ型嵌合抗原作為競爭抗原,設計了HCV血清分型的4孔檢測模式,并確定了結果判讀的計算方法。
　　采用128例HCV-1b血清和72例HCV-2a型血清對該技術進行初步的臨床評價,檢出I型102例,II型58例,I、II混合型2例,整體分型率為81.00%,與基因分型方法之間具有很好的一致性,其符合率分別為97.05%(kappa=0.959,p=0.024),接近國際報道。進一步研究顯示:本血清

13、分型方法與117例非HCV感染的肝炎及其他肝病患者血清之間沒有明顯的交叉性,且分型效率與患者的年齡、抗體S/Co、HCV RNA滴度無關。
　　本研究的創(chuàng)新之處在于采用包含C區(qū)、NS4區(qū)兩個區(qū)段的型別特異性抗原進行HCV血清分型,克服了抗體譜單一的問題,提高了樣本分型率;除此以外,本研究引入競爭免疫酶聯(lián)技術進行HCV血清分型及工藝優(yōu)化的研究,相比間接酶聯(lián)免疫技術,極大的提高了HCV血清分型的準確率。
　　本研究建立的以競爭免