HCV變異血清學(xué)檢測技術(shù)初步研究及小樣本臨床評價(jià).pdf

1、由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引起的丙型肝炎是一種十分嚴(yán)重的傳染性肝臟疾病，感染者70％慢性化，并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-3]，給我國公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了極大的危害。
　　目前對HCV的臨床治療，主要是采用長效干擾素（interferon，IFN）和利巴韋林進(jìn)行的聯(lián)合治療[4]，但存在費(fèi)用高、周期長、治愈率低的問題，對患者開展有針對性的個(gè)體化治療得到醫(yī)學(xué)界的廣泛支持[5]。但僅根據(jù) HCV

2、基因分型、病毒載量確定相應(yīng)的治療方案遠(yuǎn)不能滿足臨床個(gè)體化治療的需求。故本研究目的在于：建立一種HCV輔助檢測技術(shù)----丙型肝炎病毒變異的血清學(xué)檢測技術(shù)，通過HCV患者體內(nèi)抗變異株抗體的變化，分析患者體內(nèi)病毒的變異程度，并進(jìn)一步評價(jià)該技術(shù)在指導(dǎo)臨床用藥和預(yù)后判斷中的作用，為HCV患者提供新的個(gè)體化治療評價(jià)手段。
　　HCV是一種單股正鏈RNA病毒，1989年首次克隆成功，其基因組全長約9.5kb[6]。由于RNA酶缺少校對功能，整

3、個(gè)基因組呈現(xiàn)高度的變異性[7]，目前HCV至少分為6個(gè)基因型和80多種以上的亞型。HCV的變異除了可以形成不同的基因型和亞型之外，還重點(diǎn)體現(xiàn)在準(zhǔn)種變異上，即在同一感染者體內(nèi)存在以一條序列為主的多種變異序列共存的病毒群體[8]。研究顯示：HCV準(zhǔn)種變異的復(fù)雜程度與干擾素治療效果和臨床轉(zhuǎn)歸預(yù)后密切相關(guān)，因此，應(yīng)將準(zhǔn)種變異作為指導(dǎo)臨床治療的另一項(xiàng)重要指標(biāo)[9-10]。
　　衡量HCV準(zhǔn)種變異復(fù)雜程度通常采用的靶序列為位于E2區(qū)N端的第一

4、高變區(qū)（hypervariable region1，HVR1），目前已經(jīng)發(fā)展了克隆測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、限制酶切分析（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）等方法，通過對HVR1基因復(fù)雜程度的分析，反映 HCV整個(gè)基因組的變異情況。但上述方法離不開“HCV-RNA的提取—逆轉(zhuǎn)錄—PCR”三

5、大環(huán)節(jié)，時(shí)間長、費(fèi)用高，難以推廣于臨床。
　　本研究以HCV變異最大的HVR1為研究靶點(diǎn)，利用生物信息學(xué)手段，平行對上千條 HVR1抗原及模擬肽序列進(jìn)行篩選，獲得具有HCV變異株代表性的HVR1抗原組合，并以此為基礎(chǔ)，建立適合臨床推廣的HCV變異的血清學(xué)檢測技術(shù)，滿足HCV個(gè)體化治療的需求。
　　本研究初步建立了HCV變異的血清學(xué)檢測技術(shù)，并進(jìn)行了小樣本的臨床評價(jià)。具體結(jié)果簡述如下：
　　首先，通過Genbank、文獻(xiàn)

6、調(diào)研、自主釣取獲得了1,600條HVR1序列，采用本室自主開發(fā)的VB序列分析軟件 Biodesign構(gòu)建 HVR1變異數(shù)據(jù)庫。在對HVR1變異數(shù)據(jù)庫中的1,600條序列進(jìn)行總體分析的基礎(chǔ)上，按照30%的變異頻率，分組進(jìn)行同源比較序列篩選，最終篩選到30條HVR1變異代表序列。
　　按照大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢密碼子，人工合成了30條代表性HVR1基因的寡核苷酸片段。將其分別克隆到pBVIL1載體上，通過溫控誘導(dǎo)，30條代表性 H

7、VR1多肽在大腸桿菌中均獲得高效表達(dá)，重組 HVR1多肽的分子量為21KD左右，經(jīng)過超聲破碎，SDS-PAGE顯示，主要以包涵體形式表達(dá)，進(jìn)一步將包涵體蛋白分離、洗滌，溶于8M脲中，采用離子交換及凝膠過濾對其進(jìn)行純化。
　　我們從北京、西安、河北固安、杭州、岳陽、泰安、長春等處共收集 HCV陽性血清50份，建立本研究的全國HCV變異檢測panel，用上述純化的30條代表性重組HVR1抗原包被96孔板，采用ELISA法，對純化后變異

8、抗原的活性進(jìn)行鑒定。所篩選的HVR1抗原的交叉反應(yīng)率在26.0%~38.0%之間。綜合考慮HVR1準(zhǔn)種抗體檢測特異性及保證一定的靈敏度情況下，我們選取了編號為1，2，4，6，9，11，14，15，16，18，19，21，22，23，25，27共16條HVR1抗原作為多靶點(diǎn)組合，來檢測HVR1抗體的變化情況，該組合能覆蓋所有代表HVR1抗原與血清的交叉活性，其總的覆蓋面為95.0%（49/50）。
　　在上述多靶點(diǎn) HVR1抗原組合

9、的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了含有IgG陽性對照和表達(dá)空載體IL-1陰性對照在內(nèi)的9×6芯片矩陣，建立了HCV變異血清學(xué)檢測技術(shù)，并采用方陣滴定法，優(yōu)化反應(yīng)條件。
　　為了評價(jià)HCV變異血清學(xué)檢測技術(shù)與克隆測序金標(biāo)準(zhǔn)法之間的相關(guān)性，采用HVR1克隆測序法和HCV變異血清學(xué)技術(shù)對14位HCV患者體內(nèi)準(zhǔn)種的變異情況進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)顯示：HCV變異血清學(xué)檢測法與測序法檢測結(jié)果之間相關(guān)系數(shù) r=0.747（P<0.01）,提示可采用HCV變異血清學(xué)檢

10、測法對患者體內(nèi)準(zhǔn)種的變異情況進(jìn)行檢測。
　　評價(jià)了HCV變異的血清學(xué)檢測在疾病轉(zhuǎn)歸和預(yù)測中的作用，采用該技術(shù)對23份無癥狀、18份慢性肝病變、16份肝硬化HCV感染者進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：這3組患者 HCV血清中 HVR1抗體變異數(shù)目分別為3.09±2.68、5.72±3.83、7.44±3.90；統(tǒng)計(jì)顯示，慢性和肝硬化患者組的HCV變異程度要顯著高于急性患者組（P<0.01），提示HCV變異血清學(xué)檢測可能是一種新的HCV疾病轉(zhuǎn)歸標(biāo)

11、記物。
　　評價(jià)了HCV變異的血清學(xué)檢測在預(yù)測IFN治療效果中的作用，我們采用該技術(shù)對HCV臨床治療患者進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：干擾素有效應(yīng)答組的患者變異數(shù)目為3.91±3.09，而無效及復(fù)發(fā)患者變異數(shù)目為12.48±3.12；無效及復(fù)發(fā)組中HCV-HVR1變異程度要顯著高于有效應(yīng)答組（P<0.01），提示可以根據(jù)HCV-HVR1變異的血清學(xué)檢測對患者的治療效果做出預(yù)測，有助于臨床開展更有針對性的個(gè)體化治療。
　　綜上所述，本研