肺炎嗜衣原體抗原與血清學(xué)檢測的研究.pdf

1、肺炎嗜衣原體(Chlamydophila，C.pneumoniae，縮寫Cpn)是一種常見的呼吸道病原體，所致疾病最常見的是肺炎和支氣管炎，近年來諸多研究表明其與動脈粥樣硬化綜合癥，哮喘等疾病有關(guān)。由于Cpn為嚴格胞內(nèi)寄生性，分離培養(yǎng)較為困難，從而影響深入研究Cpn的致病機制、特異性診斷和疫苗的開發(fā)。本文應(yīng)用進口Cpn菌株，通過建立Cpn感染細胞技術(shù)，獲取大量Cpn抗原，制備斑點抗原片，用于微量免疫熒光染色(Micro-immunofl

2、uorescence，MIF)檢測血清抗體。同時根據(jù)Cpn主要外膜蛋白(Maior outer membrane protein，MOMP)核苷酸序列，構(gòu)建MOMP/pQE31重組質(zhì)粒，制備MOMP重組抗原，用于ELISA檢測診斷Cpn感染。通過對以上檢測結(jié)果的分析，較為客觀的評定每種方法的血清抗體特異性和敏感性，以便用于輔助Cpn感染的臨床診斷，探尋Cpn感染與疾病的因果關(guān)系。
　　 論文第一部分應(yīng)用進口Cpn菌株，感染Hop

3、-2細胞，分別以瑞氏.姬母薩染色、吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色和直接免疫熒光(Direct Immunofluorescence，DIF)染色三種方法鑒定Cpn感染細胞。Cpn感染Hep-2細胞的最適條件是用含1ug/ml放線菌酮的維持液，在35℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)7天，并在培養(yǎng)的第0，3，4，5天作2600rpm/min離心1h，感染成功率極高。染色反應(yīng)顯示，瑞氏-姬母薩染色可將Cpn包涵體染成藍紫色或紅紫色；

4、吖啶橙染色則顯示Cpn感染的Hep-2細胞呈現(xiàn)鮮明的橘紅色；免疫熒光抗體染色后，在Cpn感染細胞內(nèi)可見亮蘋果綠色包涵體。
　　 論文第二部分是將Cpn抗原用于制備斑點抗原片。通過建立MIF檢測血清抗體，診斷Cpn感染。用Cpn抗原片和外周血單核細胞(Peripheral BloodMononudear Cell，PBMC)抗原片分別檢測100份病人血液標本。結(jié)果顯示：用Cpn抗原片檢測血清IgG抗體，陽性率為61％；用PBMC抗

5、原片檢測，陽性率60％。經(jīng)統(tǒng)計，兩者陽性檢出率無明顯差異。用Cpn感染細胞制作的Cpn斑點抗原片可用于臨床檢測血清Cpn-IgG抗體，且具有特異性、敏感性高的特點。
　　 論文第三部分通過構(gòu)建和表達Cpn MOMP重組抗原，應(yīng)用包涵體純化法純化重組抗原后建立ELISA試驗，并檢測了82份正常人血清及臨床標本207份，其中心血管疾病血清118份，呼吸系統(tǒng)疾病血清59份，其他疾病30份。用重組抗原檢測血清IgG，正常人血清陽性檢出率

6、僅為3.7％；而207份病人血清，116份為陽性，總陽性率56.0％。其中心血管疾病血清118份，陽性69份，陽性率58.5％；呼吸系統(tǒng)疾病血清59份，陽性38份，陽性率64.4％；其他疾病患者30份，陽性9份，陽性率僅30.0％。與進口ELISA試劑盒及Cpn全抗原相比，陽性率基本相符，統(tǒng)計分析無顯著意義，但重組MOMP蛋白的抗原特異性較高，且具有抗原制備較為方便和價廉等特點。
　　 本課題通過細胞培養(yǎng)技術(shù)制備獲得大量Cpn，

7、經(jīng)瑞氏-姬母薩染色、吖啶橙染色、免疫熒光抗體染色鑒定證實為Cpn抗原。將純化的Cpn抗原制成抗原片，通過Cpn抗原片與PBMC抗原片檢測血清抗體的比較，經(jīng)統(tǒng)計顯示陽性檢出率無明顯差異。表明Cpn抗原片檢測法具有較好的敏感性和特異性，可用于臨床輔助診斷。制備重組MOMP抗原用于ELISA檢測血清抗體，結(jié)果顯示正常人及病人血清抗體效價有明顯差異，且與進口試劑盒及全抗原檢測陽性率基本相符。以重組蛋白MOMP為基礎(chǔ)建立的ELISA方法靈敏度和特