豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體ELISA檢測與基因免疫研究.pdf

1、流產(chǎn)嗜性衣原體（Chlamydophila abortus，CAB）是引起豬、牛、羊等多種動物流產(chǎn)、死胎、弱胎等慢性接觸性疾病的一種重要病原體，孕婦也可感染而發(fā)生流產(chǎn)。建立準(zhǔn)確、快速的診斷方法和研制安全、高效的疫苗是預(yù)防和控制本病的重要措施。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)獲得CAB主要外膜蛋白（MOMP）全長基因和四種不同片段大小多型性外膜蛋白90（POMP90）的編碼基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，進行原核表達獲得重組蛋白，探討了其在豬CAB感染血清學(xué)

2、檢測中的應(yīng)用價值，建立了豬CAB間接ELISA抗體檢測方法；并構(gòu)建了momp基因真核表達質(zhì)粒，及細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ編碼基因與momp基因真核共表達質(zhì)粒，比較了pcDNA3.1和PCI-neo兩種真核表達載體基因免疫效應(yīng)的差異，探索了細(xì)胞因子和中藥提取成分枸杞多糖對基因免疫的佐劑效應(yīng)。
　　 1．本研究根據(jù)已知基因序列設(shè)計引物，以流產(chǎn)嗜性衣原體CP/12株的總DNA為模板，PCR擴增了momp全長基因和四種不同片段大小的

3、pomp90基因，與pMD18-T載體連接后進行測序鑒定。將目的基因與原核表達載體pGEX-KG進行連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，在大腸桿菌E．coli BL21中實現(xiàn)了高效表達，表達產(chǎn)物經(jīng)Western-blot檢測分析，結(jié)果表明具有較強的免疫原性。進而以純化后的五種重組蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法，并對臨床血清進行了檢測。結(jié)果表明，重組MOMP蛋白不適合于建立間接ELISA抗體檢測方法，而四種重組POMP蛋白建立的間

4、接ELISA抗體檢測方法均具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確等優(yōu)點，且克服了傳統(tǒng)間接血凝試驗低靈敏度、判斷主觀性強等缺點。
　　 2．將momp基因分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1和PCI-neo，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-MOMP和PCI-MOMP，并進行了小鼠免疫試驗，比較不同真核表達載體構(gòu)建基因疫苗免疫效應(yīng)的差異。結(jié)果表明，PCI-MOMP可誘導(dǎo)更高的體液免疫效應(yīng)和微弱的細(xì)胞免疫，但未觀察到更有效的免疫保護。

5、>　　 3．將獲得的豬IL-2和IFN-γ編碼基因插入真核表達質(zhì)粒PCI-MOMP中構(gòu)建真核共表達質(zhì)粒，并通過小鼠接種試驗評價了兩種細(xì)胞因子通過真核表達質(zhì)粒混合免疫和基因共表達對基因免疫的佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明，兩種細(xì)胞因子既不能增強體液免疫效應(yīng)，也未觀察到增強的細(xì)胞免疫效應(yīng)和有效的免疫保護。
　　 4．將中藥提取成分枸杞多糖與真核表達質(zhì)粒PCI-MOMP同時對小鼠進行免疫，評價了枸杞多糖對基因免疫的佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明1，枸杞多糖