間接ELISA檢測(cè)IBV DNA疫苗免疫抗體及IBV M基因表達(dá)研究.pdf

1、本研究采用差速離心和密度梯度離心技術(shù)純化禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)，用純化的IBV作包被抗原，建立了檢測(cè)IBVDNA疫苗免疫后雞血清中特異性抗體的間接ELISA方法。確定了抗原最佳包被濃度為5μg/ml,待檢血清稀釋度為1：320，酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度為1：10000，血清樣品陰、陽(yáng)性判斷臨界值S/N為1.27?！　?yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)IBVDNA疫苗免疫抗體，結(jié)果表明：IBV的S1、M、N基因DNA疫苗單獨(dú)免疫或混合免疫均

2、能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體；且DNA疫苗各組抗體水平極顯著(P＜0.01)高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組。強(qiáng)毒攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：IBV的各DNA疫苗對(duì)強(qiáng)毒攻擊都有保護(hù)率，保護(hù)率分別是S1基因40％(8/20)、M基因70％(14/20)、N基因70％(10/14)，三基因混合DNA疫苗90％(18/20)。結(jié)合抗體檢測(cè)結(jié)果分析得出：三基因混合DNA疫苗免疫效果優(yōu)于單基因DNA疫苗免疫效果；單基因DNA疫苗中，M基因疫苗和N基因疫苗優(yōu)于S1基

3、因疫苗。　　根據(jù)本課題組設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用RT-PCR方法，獲得了IBV分離株膜蛋白基因(M)的融合表達(dá)片段，并將其克隆到pMD18-T載體測(cè)序。將此片段插入大腸桿菌原核表達(dá)載體pET30b(+)中，構(gòu)建了表達(dá)IBVM基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pET30-M，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，并經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting分析表明：M基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，表達(dá)蛋白分子量約為26