禽和豬冠狀病毒的檢測及IBV H52疫苗株的動物散毒試驗.pdf

1、　　本文參考GenBank上登錄的冠狀病毒屬各成員基因序列，根據(jù)其pol基因的一個共同保守區(qū)，設(shè)計合成一對通用型引物，通過對雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)參考株RNA進(jìn)行RT-PCR擴增，均得到預(yù)期大小為251bp的核酸片段，從而建立起以該引物為基礎(chǔ)的通用型RT-PCR。用該通用型RT-PCR，分別檢測禽疑似IBV樣品64份，陽性29份；豬疑似TGEV樣品26份，陽性5份。對所檢測到的陽性樣品的RT-PC

2、R產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示所檢測目的片段與所報道的IBV或TGEV對應(yīng)基因片段相符。該引物不擴增新城疫病毒、禽流感病毒、豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒等的核酸。表明該通用型RT-PCR能檢測IBV和TGEV，從而為用該方法檢測其他冠狀病毒、追蹤和鑒定未知冠狀病毒提供了技術(shù)支持?！　膸в须u傳染性支氣管炎病毒(IBV)pol基因cDNA片段重組質(zhì)粒中擴增、回收251bp目的片段，利用隨機引物標(biāo)記法制備檢測IBV病毒核酸的地高辛(DIG)標(biāo)

3、記探針。該探針結(jié)合已建立的RT-PCR法，檢測64份疑似臨床病料，31份陽性；而RT～PCR擴增結(jié)合核酸測序確診為陽性的只有29份。探針最低能檢出量約3.4pg的IBV反轉(zhuǎn)錄物；與新城疫病毒、傳染性囊病病毒、禽流感病毒、正常雞胚尿囊液、正常雞腎組織等的RT-PCR產(chǎn)物雜交呈陰性。表明利用DIG探針結(jié)合RT-PCR檢測IBV，敏感性強，可重復(fù)性好，能克服RT-PCR非特異性反應(yīng)和探針Northern雜交的不穩(wěn)定性。　　IBVH52疫苗接

4、種1月齡非免疫雛雞，采集其接種后1月內(nèi)咽喉和肛門拭子，用已建立的RT-PCR/DIG方法進(jìn)行檢測，同時用9日齡SPF雞胚接種陽性樣品，并用RT-PCR法擴增接種樣品的雞胚尿囊液RNA。實驗中，咽喉拭子最早檢測到病毒是接種后第1天，檢測結(jié)果為陽性的樣品有第1-7天、第10天，共8份；肛門拭子最早檢測到病毒是接種后第4天，陽性樣品有第4、6、19、20、25、29、30天，共7份。顯示弱毒疫苗接種雞體后，在1月內(nèi)能持續(xù)向外排毒。因此，IBV