動(dòng)物冠狀病毒的檢測(cè)及應(yīng)用研究.pdf

1、冠狀病毒獨(dú)特的先導(dǎo)引物轉(zhuǎn)錄機(jī)制，導(dǎo)致了冠狀病毒抗原變異株層出不窮以及具有很高的重組率，這都給動(dòng)物冠狀病毒的檢測(cè)與防制帶來(lái)了很大的困難。因此，建立有效的動(dòng)物冠狀病毒檢測(cè)方法，對(duì)有效控制動(dòng)物冠狀病毒的流行非常重要。 參考GenBank中公布的冠狀病毒相關(guān)序列，根據(jù)動(dòng)物冠狀病毒聚合酶基因的保守區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，建立一種動(dòng)物冠狀病毒通用PCR方法。用這種方法可以檢測(cè)是否為冠狀病毒感染，而且不同群的冠狀病毒都可以用這一對(duì)引物進(jìn)行簡(jiǎn)潔、

2、快速地診斷。特異性試驗(yàn)表明將CCV、FCV等冠狀病毒用通用PCR方法均擴(kuò)增出449bp目的條帶，而陰性對(duì)照沒(méi)有。敏感性試驗(yàn)表明，其敏感程度同于常規(guī)PCR方法。通過(guò)克隆測(cè)序?qū)⒉煌《镜木酆厦富蚺c相應(yīng)病毒的不同毒株BLAST，同源性為96﹪～99﹪，表明通用引物用于擴(kuò)增冠狀病毒的正確性。將擴(kuò)增的聚合酶基因與冠狀病毒的參考毒株進(jìn)行同源性比對(duì)結(jié)果在56.69﹪～99.55﹪之間。進(jìn)化樹分析FCV、TGEV、FIPV、CCV、PRCV、HCV-

3、229E為一個(gè)抗原群，BCV、HCV-Paris、MHV-A59為另一個(gè)抗原群，SARS為新的一個(gè)抗原群。這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)中對(duì)冠狀病毒根據(jù)血清學(xué)與基因?qū)W角度分類報(bào)道的一致。 在基因芯片研制成功的基礎(chǔ)上，對(duì)不同動(dòng)物冠狀病毒進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，將攻毒的組織樣品利用多重PCR擴(kuò)增以Cy3為標(biāo)記物與基因芯片上多個(gè)基因克隆進(jìn)行雜交，同時(shí)將基因芯片檢測(cè)的結(jié)果與RT-PCR、病原組織分離鑒定的結(jié)果進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于RT-PCR和病原組織

4、分離鑒定為陰性的樣品基因芯片檢測(cè)呈陽(yáng)性，而且可以得出RT-PCR檢測(cè)比病原組織分離鑒定更靈敏。因此，從基因芯片應(yīng)用的角度用實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因芯片技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物冠狀病毒比其他的方法更靈敏、更準(zhǔn)確。 根據(jù)NCBI中公布犬冠狀病毒Tn449株的基因序列，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出S基因890bp的片段，克隆測(cè)序并與參考毒株進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明CCVTn449株與CCV的UCD-1株和Emlo/02株同源性最低，尤其是Emlo/02