禽痘病毒疫苗及野毒株重組禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的研究.pdf

1、禽痘(Avian pox，AP)是由痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科、禽痘病毒屬中的禽痘病毒引起的家禽的一種急性、接觸性傳染病。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病(reticuloendotheliosis，RE)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的禽網(wǎng)內(nèi)皮組織增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)引起的幾種禽類的一群病理綜合征，REV基因片段整合迸FPV疫苗、基因片段甚至完整的基因組整合進(jìn)FPV野毒株已成為普遍現(xiàn)象。研究表明，隨著F

2、PV和REV整合的不斷發(fā)展，其對于痘病毒的增殖和感染都有促進(jìn)作用。而且這種整合對FPV的生物特性產(chǎn)生很大影響，其中最明顯的表現(xiàn)為FPV疫苗保護(hù)力的下降;野毒致病力的增強(qiáng)等。
　　本研究通過對2012-2014年國內(nèi)外不同地區(qū)、不同批次的12個(gè)FPV疫苗株以及來自泰安某地區(qū)的3個(gè)火雞痘及1個(gè)雞痘野毒株中整合REV進(jìn)行分離鑒定及其序列比較，以評估國內(nèi)外當(dāng)前使用FPV疫苗的缺陷、潛在風(fēng)險(xiǎn)以及FPV中REV的污染狀況。
　　12個(gè)禽

3、痘疫苗株接種CEF傳代至出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，提取細(xì)胞DNA，根據(jù)已發(fā)表的整合序列，PCR擴(kuò)增FPV-REV5'LTR整合區(qū)，同時(shí)分段擴(kuò)增REV的LTR、Env、Gag、Pol序列，結(jié)果表明，12個(gè)禽痘疫苗株均擴(kuò)增出含REV5'LTR和FPV片段在內(nèi)的產(chǎn)物，但未擴(kuò)增到REV的Env、Gag、Pol序列。對FPV-REV5'LTR整合區(qū)序列進(jìn)行測定，經(jīng)NCBI、DNA-star比對分析，其中2個(gè)國外疫苗株整合了446bp的REV-LTR序列

4、，與中國近年分離到的REV野毒株HA9901的同源性為98％，與美國標(biāo)準(zhǔn)株SNV的同源性為94.3％;另外10個(gè)國內(nèi)疫苗株整合的REV LTR片段相對較小，僅為194bp，與中國近年分離到的REV野毒株HA1101、HA9901的同源性分別為98.4％和96.4％，與美國標(biāo)準(zhǔn)株SNV的同源性為94.3％。10個(gè)國內(nèi)疫苗株整合區(qū)與國外已發(fā)表的禽痘毒株AY255632、HP-438的同源性分別為98.6％和100％，2個(gè)國外疫苗株整合區(qū)與A

5、Y255632的同源性達(dá)到100％。結(jié)果表明所檢測的12個(gè)禽痘疫苗株只整合部分REV LTR序列，并且與REV的分離株同源性不高，但與國外禽痘分離株整合區(qū)的同源性較高。
　　分離到的3個(gè)火雞痘與1個(gè)雞痘野毒株經(jīng)雞胚連續(xù)傳代至出現(xiàn)痘斑，研磨后接種CEF傳代至出現(xiàn)CPE，提取細(xì)胞DNA，結(jié)果除擴(kuò)增到485bp的FPV-REV5'LTR整合區(qū)以外，同時(shí)擴(kuò)增到REV的Env基因(1700bp)、Gag基因(2050bp)及Pol基因(34

6、50bp)。序列分析表明，4個(gè)野毒株的FPV-REV5'LTR整合區(qū)同源性達(dá)99.8％-100％，且與國內(nèi)疫苗株的整合區(qū)高度同源。同時(shí)選取T1毒株人工感染20只SPF雞，使用ELISA方法檢測血清中REV抗體，攻毒前REV抗體陽性率為0％(0/20)，攻毒兩周后陽性率為100％(20/20)。剖檢發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)免疫器官及其他器官的病變，包法氏囊萎縮出血，胸腺萎縮出血，氣管出血并伴有粘液，腎臟腫大等癥狀，可能與FPV野毒中的REV有關(guān)，但還需進(jìn)