豬δ冠狀病毒抑制IFn-β產(chǎn)生的機(jī)制研究.pdf

1、豬δ冠狀病毒(PDCoV)屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬，能造成母豬和仔豬的腹瀉、嘔吐、脫水，嚴(yán)重者可致死。自2014年初美國(guó)俄亥俄州的豬場(chǎng)爆發(fā)母豬和仔豬腹瀉病以來(lái)，該病毒迅速傳播至美國(guó)其它州以及韓國(guó)、加拿大和中國(guó)大陸，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。
　　干擾素以及干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病毒入侵的重要防御機(jī)制。為了抵抗干擾素的抗病毒效應(yīng)，冠狀病毒在其進(jìn)化過(guò)程中能采用不同的策略來(lái)逃避宿主的天然免疫反應(yīng)，其中α冠狀病

2、毒、β冠狀病毒以及γ冠狀病毒逃避天然免疫的分子機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究，因此我們推測(cè)PDCoV也進(jìn)化出了逃避抗病毒免疫反應(yīng)的策略。為了揭示PDCoV感染與天然免疫之間的關(guān)系及機(jī)制，本文對(duì)PDCoV感染細(xì)胞后干擾素的產(chǎn)生情況及其信號(hào)通路展開(kāi)了研究。具體內(nèi)容如下:
　　1.PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上生長(zhǎng)特性的研究
　　首先我們研究不同胰酶濃度的培養(yǎng)基對(duì)PDCoV引起LLC-PK1細(xì)胞病變的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV對(duì)LLC-PK

3、1細(xì)胞的感染需要一定濃度的胰酶，且各時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的病變程度和細(xì)胞脫落程度都隨胰酶濃度增加而加大，其中當(dāng)使用胰酶濃度為10ug/mL的培養(yǎng)基時(shí)，PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞在24 h開(kāi)始出現(xiàn)病變，但病變程度輕微，且無(wú)細(xì)胞脫落;同時(shí)我們還研究了PDCoV引起的細(xì)胞病變與接種劑量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV引起的LLC-PK1細(xì)胞的病變時(shí)間與病變程度都隨接種劑量的增加而增大，當(dāng)接種量為0.01 moi時(shí)，細(xì)胞在24 h開(kāi)始出現(xiàn)病變，但病變程

4、度輕微，且無(wú)細(xì)胞脫落，與上述胰酶濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞后感染率隨時(shí)間的推移而增大，在感染24 h后感染率能達(dá)到較高水平且無(wú)細(xì)胞脫落;病毒滴定測(cè)定結(jié)果顯示病毒滴度在感染過(guò)程中呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，在感染24 h后病毒滴度能達(dá)到107.2 TCID50/mL。因此PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞后在24 h能達(dá)到較高感染率且無(wú)細(xì)胞脫落，它將作為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)所選擇的最佳時(shí)間點(diǎn)。
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5、.PDCoV感染后IFN-β、NF-κB和IRF3的產(chǎn)生情況研究
　　采用IFN-β啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞之后IFN-β的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染不僅不能激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄，并且還能抑制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β的轉(zhuǎn)錄，且呈現(xiàn)PDCoV接種劑量依賴性;進(jìn)一步采用NF-κB和IRF3啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞之后NF-κB和IRF3

6、的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染不能激活NF-κB和IRF3的啟動(dòng)子活性，并且還能抑制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的NF-κB啟動(dòng)子活性和IRF3啟動(dòng)子活性。該結(jié)果表明PDCoV能通過(guò)抑制NF-κB和IRF3轉(zhuǎn)錄因子的活性從而抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性。
　　3.PDCoV抑制IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路研究
　　SeV和poly(I∶C)是RIG-I樣受體介導(dǎo)的IFN-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵誘導(dǎo)物，因此我們推測(cè)PDCoV抑

7、制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生很有可能是通過(guò)阻斷了RIG-I信號(hào)通路上的某個(gè)信號(hào)分子。為了驗(yàn)證這種可能性及其分子機(jī)制，我們研究鑒定了PDCoV阻斷SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄的靶蛋白。在RIG-I信號(hào)通路的分析中，通過(guò)對(duì)RIG-I、RIG-IN、MDA5、IPS-1、TBK1、IKKε、IRF3和IRF3(5D)的超表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)PDCoV感染能抑制IRF3及其上游信號(hào)分子(RIG-I/RIG-I

8、N、MDA-5、IPS-1、TBK1和IKKε)誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，但不會(huì)影響IRF3的組成激活型IRF3(5D)激活的IFN-β啟動(dòng)子活性，表明PDCoV能夠靶向IRF3阻斷RIG-I信號(hào)通路，從而抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄。
　　4.PDCoV感染后IRF3和P65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位研究
　　PDCoV能夠抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB的啟動(dòng)子活性，而磷酸化與核轉(zhuǎn)位是IRF3和NF-κB(P65)活化的標(biāo)志，因此我