IFN-α抑制卵巢漿液性囊腺癌增殖和腹膜轉(zhuǎn)移機制的研究.pdf

1、本文通過檢測了52例卵巢漿液性囊腺癌組織中HIF-1α、VEGF、bFGF、CD34蛋白的表達情況，及上述因子在31例晚期患者腹水及轉(zhuǎn)移灶中的表達情況，探討HIF-1α、VEGF、bFGF在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、腹水形成和腹膜播散中的作用，探討其與預后的關(guān)系。建立卵巢漿液性囊腺癌細胞株低氧模型，檢測在低氧條件下IFN-α干預后，HIF-1α、VEGF、bFGF的蛋白表達變化，研究IFN-α在低氧條件下對卵巢漿液性囊腺癌細胞株OVCAR<,3

2、>增殖和血管生成的作用，進一步探討IFN-α抑制卵巢漿液性囊腺癌腹腔播散轉(zhuǎn)移的機制。 研究材料與方法： 一、病例資料 自2001年8月～2005年1月在中國醫(yī)科大學第一臨床學院診斷為卵巢漿液性囊腺癌的病人52例，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證實，由同一病理專家復核確認?；颊吣挲g22～71歲，平均(45.2±12.3)歲，術(shù)前均未接受放射治療及化學藥物治療。病理分化程度：高分化11例，中分化16例，低分化25例；臨床分期[

3、按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FICO)標準，2000年]：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期30例，Ⅳ期2例；無腹水者21例，有腹水者31例。其中3例行全子宮切除，雙附件切除術(shù)，41例行腫瘤細胞減滅術(shù)，殘留病灶直徑≤2cm(其中4例行部分結(jié)腸或直腸切除術(shù))，8例行腫瘤細胞減滅術(shù)，殘留病灶直徑>2cm。其中49例患者術(shù)后給予CP或TP方案化療6-8個療程，52例患者中21人復發(fā)。所有患者均隨訪(隨訪時間22個月-39個月)，隨訪內(nèi)容包括：盆腔檢查、CA1

4、25測定、盆腹腔超聲檢查，術(shù)后頭兩年，3個月一次，以后6個月一次。另外，對有腹水的31例晚期患者，分別取腹水沉渣和腹腔轉(zhuǎn)移灶進行檢測，轉(zhuǎn)移灶部位：23例為大網(wǎng)膜，13例為闌尾，3例為腹壁，2例為結(jié)腸。 卵巢漿液性囊腺瘤20例，年齡20～76歲，平均年齡(42.7±13.5)歲，卵巢交界性漿液性囊腺瘤9例，年齡20～71歲，平均年齡(47.7±15.2)歲，正常卵巢組織10例，年齡為28～66歲，平均年齡為(48.3±11.6)歲

5、。 二、研究材料： 鼠抗人：HIF-1α多克隆抗體、survivin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人VEGF、bFGF單克隆抗體，鼠抗人tubulin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人CD34、PCNA單克隆抗體購自北京中山試劑公司，二抗羊抗鼠、羊抗兔單克隆抗體購自北京中山試劑公司，VEGF和bFGF試劑盒購于美國R&D公司，bFGF購自深圳晶美試劑公司，IFN-αⅡb購于北京三元基因公司

6、，4℃保存，PI購自美國Sigma公司，CoCL<,2>購白沈陽化學試劑廠，ECL，發(fā)光試劑盒購自美國PE公司。 三、研究方法： 1、腫瘤組織原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶HIF-1α、VEGF、bFGF、CD4、PCNA免疫組化檢測，采用S-P免疫組化二步法。 2、腹腔液細胞HIF-1、VEGF、bFGF免疫細胞化學檢測，采用En Vision免疫細胞化學染色法。 3、血清和腹腔液上清VEGF及bFGF水平檢測，采用雙

7、抗體夾心ELISA法。 4、采用CoCL<,2>建立細胞化學性低氧模型。 5、采用MTT法測定增殖率和抑制率。 6、采用FACScan流式細胞儀進行細胞凋亡檢測和細胞周期解析。 7、采用Western blot解析細胞株HIF-1α、VEGF、bFGF和survivin的蛋白表達。 實驗研究結(jié)果： 1、HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢漿液性囊腺癌中的高表達率明顯高于正常卵巢組織和

8、卵巢漿液性囊腺瘤，其差異有顯著性(P<0.001)；而且HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢交界性漿液性囊腺瘤的高表達率也高于正常卵巢組織和卵巢漿液性囊腺瘤，差異有顯著性(P<0.001)。 2、低分化、Ⅲ期+Ⅳ期和腹水陽性HIF-1α蛋白的高表達率明顯高于高中分化、Ⅰ期+Ⅱ期和腹水陰性者，差異具有顯著性(P<0.05)；HIF-1α蛋白表達與年齡無關(guān)，差異無顯著性(P>0.05)。 3、HIF-1α蛋白高表達與V

9、EGF、bFGF高表達及MVD具有明顯的正相關(guān)(P<0.01)，150μmol/LCoCL2處理OVCAR<,3>細胞24小時，可上調(diào)細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達，對bFGF蛋白表達無影響。 4、常氧培養(yǎng)條件下，不同濃度的bFGF作用OVCAR<,3>細胞24小時，25、50和100ng/ml的bFGF均上調(diào)OVCAR<,3>細胞HIF-1α蛋白表達，且呈濃度依賴性(P<0.01)；50 ng/ml的bFGF分別作用OVC

10、AR<,3>細胞6、12、24和48小時，均上調(diào)OVCAR<,3>細胞HIF-1α蛋白表達，且呈時間依賴性(P<0.01)。 5、HIF-1α、VEGF蛋白在31例晚期卵巢漿液性囊腺癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中的表達高于腹水中的表達(P<0.05)，bFGF蛋白在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和腹水的高表達率分別是83.9％、90.3％和61.3％，無顯著差異(P>0.05)。 6、卵巢漿液性囊腺癌患者血清中VEGF、bFGF平均水平明顯高于正常

11、對照、卵巢漿液性囊腺瘤和卵巢交界性漿液性囊腺瘤患者(P<0.05)，腹水中VEGF、bFGF平均水平明顯高于血清(P<0.01)。 7、殘留病灶、HIF-1α、VEGF、bFGF高表達及MVD與卵巢漿液性囊腺癌的復發(fā)或轉(zhuǎn)移具有明顯的正相關(guān)(P<0.05)。Cox模型分析，VEGF高表達及MVD是晚期卵巢漿液性囊腺癌的獨立預后因素(P<0.05)。 8、 150μmol/LCoCL<,2>作用48小時誘導OVCAR<,3>

12、細胞Go/G<,1>期阻滯，未見明顯凋亡。 9、 150μmol/LCoCL<,2>作用24小時下調(diào)survivin蛋白表達，survivin蛋白表達與HIF-1α呈負相關(guān)(P<0.001)。 10、低氧培養(yǎng)條件下，10<'2>、10<'3>和10<'4>TU/ml的IFN-αⅡb均下調(diào)OVCAR<,3>細胞：HIF-1α、VEGF蛋白表達，且呈濃度依賴性(P<0.05)。濃度為10<'2> IU/ml的IFN-αⅡb分

13、別作用OVCAR<,3>細胞6、12、24和48小時，HIF-1α、VEGF蛋白表達均下調(diào)，且呈時間依賴性(P<0.05)。 11、濃度為10<'2>IU/ml的IFN-αⅡb作用72小時和10<'3>IU/ml的IFN-αⅡb作用48、72小時和10<'4>IU/ml的IFN-αⅡb作用24、48、72小時對OVCAR<,3>細胞的增殖均具有一定的抑制作用(P<0.05)。 12、低氧培養(yǎng)24小時， 10<'3>和10

14、<'4>IU/ml的IFN-αⅡb誘導OVCAR<,3>細胞S-G<,2>/M期阻滯，在本實驗中，未見明顯細胞凋亡。 13、低氧培養(yǎng)條件下，10<'2>、10<'3>和10<'4>IU/ml的IFN-αⅡb均下調(diào)OVCAR<,3>細胞survivin蛋白表達，與對照相比，差異顯著(P<0.001)，無濃度依賴性(P>0.05)。 研究結(jié)論: 1、HIF-1α、VEGF和bFGF在卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生、侵襲和腹膜轉(zhuǎn)

15、移中有重要的作用。 2、bFGF通過上調(diào)卵巢癌OVCAR<,3>細胞HIF-1α蛋白表達而促進VEGF蛋白表達。 3、VEGF及MVD是晚期卵巢漿液性囊腺癌的獨立預后因素。 4、HIF-1α下調(diào)survivin蛋白表達，誘導G<,0>/G<,1>期細胞阻滯，上調(diào)VEGF蛋白表達，促進腫瘤血管生成。 5、IFN-αⅡb通過下調(diào)survivin蛋白表達，誘導S-G<,2>/M期阻滯和下調(diào)HIF-1α蛋白表達抑