Wip1在卵巢漿液性囊腺癌細胞凋亡、侵襲中的作用及相關分子機制.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，也是導致女性死亡的常見的惡性腫瘤。由于卵巢癌早期癥狀不典型，絕大多數(shù)患有卵巢癌的女性發(fā)現(xiàn)時已是晚期，腫瘤已擴散至卵巢以外的器官，卵巢癌的5年生存率只有30-40％。盡管手術和化療方案不斷改進，但是大多數(shù)患者往往會復發(fā)，預后很差。因此，卵巢癌嚴重威脅著廣大女性的身體健康。目前關于卵巢癌的具體發(fā)病機制仍然不十分清楚。細胞凋亡是人體內細胞死亡的主要途徑之一，其過程受機體的嚴格調控，調控失衡可引起細胞異常

2、增殖或異常凋亡，導致相關疾病的發(fā)生。
　　研究表明，卵巢癌細胞凋亡異常是導致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。野生型p53誘導的蛋白磷酸酶1（Wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1）是1997年發(fā)現(xiàn)的一種依賴于p53的原癌基因，它廣泛參與調控多種細胞信號通路，對卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生起重要作用。Wip1是一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由PPM1D(Protein phasphatase magnes

3、ium-dependent1 delta)基因編碼，主要定位于細胞核內，位于人染色體17q23/q24區(qū)域,是PP2C（protein phosatase type2C）家族中的一員。研究顯示W(wǎng)ip1基因與細胞凋亡關系密切。有研究將大鼠暴露于錳環(huán)境中造成神經(jīng)壞死并制成大鼠模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加而神經(jīng)組織及細胞中Wip1的表達量則顯著下降。還有研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌和腎癌組織中Wip1的表達水平均顯著高于其正常組織，沉默Wip1

4、后兩種癌細胞的凋亡明顯增加。在HeLa細胞中，沉默Wip1顯著降低細胞的生長和增殖，而細胞凋亡增加，p-p38 MAPK、p-p53、p53蛋白的表達也顯著增加。因此，Wip1參與了抑制癌細胞凋亡的過程。Wip1表達升高具有抑制細胞凋亡的作用。Wip1在乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、髓母細胞瘤等多種惡性腫瘤組織存在高表達，提示W(wǎng)ip1與惡性腫瘤的關系密切。
　　關于Wip1在卵巢漿液性囊腺癌細胞凋亡中的作用及相關機制的研究目前尚未見報道。

5、因此，本課題通過免疫組織化學染色法、Real-Time PCR、Western blot方法觀察Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達情況并分析其與臨床病理特征的關系，采用小干擾RNA技術、Real-Time PCR、Western blot、Transwell等技術研究Wip1對卵巢癌SKOV3細胞凋亡、侵襲的影響，以闡明Wip1在卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。
　　第一部分：Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達及意

6、義
　　目的：探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達情況以及Wip1與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關系。
　　方法：選取2012年9月至2014年12月期間河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦科手術經(jīng)病理檢查確診的患者標本80例為研究對象，其中卵巢漿液性囊腺癌50例,交界性卵巢漿液性囊腺瘤20例和因子宮肌瘤行全子宮+雙側附件切除術且病理證實為正常卵巢組織10例。患者年齡45-67歲之間，中位年齡57歲，所有病例

7、術前無化療及放療史。按FIGO(2014)標準進行手術病理分期：Ⅰ、Ⅱ期20例，Ⅲ、Ⅳ期30例；組織學分級按照WHO標準：高分化、中分化、低分化分別為21例、7例和22例；淋巴結轉移30例，無轉移20例。標本取材后部分置于-196℃液氮中速凍，然后轉至-80℃冰箱內保存，部分標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組化染色。
　　通過免疫組化技術, RT-PCR及Western blot對卵巢漿液性囊腺癌組織中的Wip1的表達進行研

8、究,并結合臨床病理資料進行分析,以探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌中的表達情況及其與卵巢漿液性囊腺癌患者臨床分期、淋巴結轉移及組織病理分化程度的關系。
　　結果：
　　1、免疫組化檢測Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達
　　Wip1表達于卵巢漿液性囊腺癌細胞的胞核及胞漿，在卵巢漿液性囊腺癌組織中陽性表達率為68%，在交界性卵巢漿液性囊腺瘤組織中陽性表達率為60%，在正常卵巢上皮細胞中未見表達，三組比較差異有統(tǒng)計學意義

9、（確切概率法P=0.001)。
　　2、 RT-PCR檢測Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達
　　Wip1mRNA表達在卵巢漿液性囊腺癌（3.1±0.19）高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在交界性卵巢漿液性囊腺瘤（2.5±0.23）較正常卵巢組織增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在卵巢漿液性囊腺癌中的表達與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3、 West

10、ern blot檢測Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達
　　Wip1蛋白表達在卵巢漿液性囊腺癌（0.81±0.15）高于正常卵巢組織（0.45±0.22），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在交界性卵巢漿液性囊腺瘤（0.82±0.19）高于正常卵巢組織（0.45±0.22），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在卵巢漿液性囊腺癌中的表達與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4、 Wip1表

11、達與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關系
　　4.1、 Wip1表達與臨床病理分期的關系
　　分為Ⅰ、Ⅱ期組及Ⅲ、Ⅳ期組兩組，Wip1在兩組卵巢漿液性囊腺癌組織中的陽性表達率分別為50%及80%，隨著臨床期別的升高Wip1的陽性表達率逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.963，P=0.026）。
　　4.2、 Wip1表達與組織學分級的關系
　　Wip1在高分化、中分化、低分化卵巢漿液性囊腺癌組織中陽性表達

12、率分別為52.38%、71.43%及81.82%，三組比較陽性表達率呈增高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(確切概率法P=0.118)。
　　4.3、 Wip1表達與淋巴結轉移的關系
　　Wip1在淋巴結轉移組中陽性表達率為83.33%，在無淋巴結轉移組中Wip1陽性表達率為45%，兩組比較有顯著性差異(χ2=8.104, P=0.004)。
　　小結：Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達，與淋巴結轉移、臨床分期、組織學分級密

13、切相關。表明Wip1參與了卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病機制的研究提供了新的理論依據(jù)。
　　第二部分：Wip1在卵巢癌細胞系中的表達、篩選與沉默
　　目的：探討Wip1在不同卵巢癌細胞系中的表達情況，篩選出Wip1強表達的細胞系，為進一步研究Wip1在卵巢癌細胞系中的作用機制奠定基礎。
　　方法：應用RT-PCR及Western blot檢測正常卵巢上皮細胞及卵巢癌細胞株SKOV3、CAOV3

14、、A2780、ES2中Wip1mRNA及蛋白的表達。最終篩選出SKOV3作為實驗細胞株。
　　在卵巢癌SKOV3細胞中沉默Wip基因觀察其生物學行為的變化。在體外合成Wip1特異性的三對siRNA（Wip1-siRNA-1、Wip1-siRNA-2、Wip1-siRNA-3）,一對siRNA陰性對照。Lipofectamine2000介導siRNA轉染SKOV3細胞株。實驗分組如下：（1）Control組（SKOV3細胞組）（2）

15、 N-siRNA組：轉染陰性siRNA（3）實驗組：轉染W(wǎng)ip1-siRNA（1、2、3）者。Western blot檢測轉染后Wip1蛋白表達的變化，并選擇出最有效的Wip1-siRNA-2做后續(xù)實驗。按照操作步驟每組設置好相應平行孔,將各組細胞依次分別接種至96孔板，培養(yǎng)24小時后進行轉染,分別于轉染后0小時、24小時、48小時、72小時 Western blot檢測轉染后Wip1蛋白表達的變化；選用siRNA的濃度分別是20nmo

16、l/L，40nmol/L，80nmol/L時作用SKOV3細胞，Western blot檢測轉染后Wip1蛋白表達的變化,篩選出Wip1-siRNA-2作用的最佳時間（48h）及Wip1-siRNA-2作用的最佳濃度（80nmol/L）。
　　結果：
　　1、 Real-time PCR檢測卵巢正常上皮細胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細胞株中Wip1mRNA表達
　　Wip1mRNA表達在SKOV3細胞

17、中（3.85±0.23）明顯高于正常上皮細胞，有顯著性差異（P<0.01），在CAOV3（1.73±0.46）、A2780（1.89±0.28）、ES2（1.81±0.19）細胞中也均高于卵巢正常上皮細胞，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2、 Western blot檢測卵巢正常上皮細胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細胞株中Wip1蛋白的表達
　　Wip1蛋白表達在SKOV3（0.73±0.09）、A278

18、0（0.54±0.039）、ES2（1.17±0.08）細胞中明顯高于正常上皮細胞（0.15±0.038），有顯著性差異（P<0.01），在CAOV3（0.25±0.045）細胞中也高于卵巢正常上皮細胞，有顯著性差異（P<0.05）。
　　通過檢測SKOV3、CAOV3、AZ780、ES2細胞中Wip1的表達，發(fā)現(xiàn)Wip1在SKOV3細胞中mRNA與蛋白的表達明顯高于其他三種細胞，因此后續(xù)采用SKOV3細胞進一步研究Wip1與卵巢

19、漿液性囊腺癌的關系。
　　3、沉默Wip1對SKOV3細胞的影響
　　轉染siRNA-2的SKOV3細胞中Wip1蛋白表達最少，Wip1-siRNA-2轉染SKOV3細胞后，Wip1的表達隨著其濃度的增加呈減少趨勢，在濃度為80nmol/L達到最低值；而作用時間為48小時Wip1蛋白表達也達到最低。提示， Wip1-siRNA轉染SKOV3細胞在特定濃度和作用時間時影響最大（P<0.01）。
　　小結：在SKOV3、C

20、AOV3、A2780、ES2細胞中均發(fā)現(xiàn)Wip1有過表達現(xiàn)象，其在SKOV3細胞中表達水平最高，Wip1-siRNA轉染SKOV3細胞在特定濃度和作用時間時沉默效果最好，為進一步闡述其分子機制提供了理論支持。
　　第三部分：沉默Wip1對卵巢癌細胞凋亡的影響
　　目的:探討沉默Wip1對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的作用及相關的分子機制。
　　方法：AnnexinⅤ/PI染色檢測Control組、N-siRNA組、Wip

21、1-siRNA（2）（Wip1-siRNA）組中SKOV3細胞凋亡率。RT-PCR檢測Control組、N-siRNA組、Wip1-siRNA組中Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2mRNA的表達。Western blot檢測Control組、N-siRNA組、Wip1-siRNA組中Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、p38 MAPK、p-p

22、38MAPK、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表達。為明確p38 MAPK信號通路是否參與了SKOV3細胞凋亡，加入P38 MAPK特異性抑制劑SB203580后檢測p-p38及p38的表達情況。
　　結果：
　　1、流式細胞技術檢測沉默Wip1對SKOV3細胞凋亡率的影響
　　AnnexinⅤ/PI染色結果表明，與Control組相比，Wip1-siRNA組沉默Wip1后SKOV3細胞凋亡率顯著增加（P<

23、0.01）；與N-siRNA組相比， Wip1-siRNA組SKOV3細胞凋亡率也顯著增加（P<0.01）。此外， N-siRNA組與Control組相比SKOV3細胞的凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　2、 RT-PCR檢測沉默Wip1對SKOV3細胞凋亡相關基因表達的影響
　　為研究沉默Wip1后SKOV3細胞凋亡發(fā)生情況，對凋亡相關基因Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-

24、3、P53、Bcl-2表達情況進行檢測，沉默Wip1后，SKOV3細胞中P53mRNA（2.5±0.034）較Control組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果提示：沉默Wip1后能夠促進SKOV3細胞的凋亡。
　　3、 Western blot檢測沉默Wip1對SKOV3細胞

25、凋亡相關蛋白表達的影響
　　為研究沉默Wip1后SKOV3細胞凋亡發(fā)生情況，對凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表達情況進行檢測，沉默Wip1后，SKOV3細胞中P53蛋白（1.02±0.039）較Control組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01）；Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高，差異有統(tǒng)

26、計學意義（P<0.01）。結果提示：沉默Wip1后能夠促進SKOV3細胞的凋亡。
　　4、沉默Wip1通過 p38 MAPK信號通路誘導SKOV3細胞的凋亡
　　沉默Wip1后檢測SKOV3細胞中ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38的蛋白表達， P-P38的蛋白表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05），提示P-P38可能參與了SKOV3細胞的凋亡。為明確p38 MAPK信號通路是否參與了SKOV3

27、細胞的凋亡，加入P38MAPK的特異性抑制劑SB203580，p-p38的蛋白表達則明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　小結：沉默Wip1能夠促進人卵巢癌SKOV3細胞凋亡可能是通過上調P53、cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比率，活化P38MAPK信號通路而實現(xiàn)的。
　　第四部分：沉默Wip1對卵巢癌細胞侵襲的影響
　　目的：探討Wip1與卵巢癌細胞SKOV3侵

28、襲力的關系，揭示W(wǎng)ip1對SKOV3細胞的侵襲和遷移等惡性生物學行為的影響。
　　方法：劃痕實驗、Transwell小室法測定Wip1沉默后SKOV3細胞體外侵襲能力。RT-PCR檢測SKOV3細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達；Western blot檢測SKOV3細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達
　　結果：
　　1、劃痕實驗測定Wip1-siRN

29、A沉默Wip1基因對SKOV3細胞體外侵襲能力的影響
　　Wip1-siRNA組細胞遷移距離（30.333±3.670）明顯短于Control組（59.333±7.685）,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01）；N-siRNA組和Control組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　2、 Transwell小室法測定Wip1-siRNA沉默Wip1基因對SKOV3細胞體外侵襲能力的影響
　　Wip1-siRNA轉染S

30、KOV3細胞后使其侵襲基底膜能力受到顯著抑制， SKOV3細胞侵襲到 Transwell小室濾膜下細胞數(shù) Wip1-siRNA組為（17.167±1.835），顯著低于Control組（31.167±3.43）和 N-siRNA組（29.667±4.179），差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01）；N-siRNA組和Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3、 RT-PCR檢測沉默Wip1后SKOV3細胞中MMP-2

31、、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達
　　Wip1-siRNA組 MMP-2mRNA（0.51±0.013）和 MMP-9 mRNA（0.4±0.028）的表達較Control組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Wip1-siRNA組TIMP-1mRNA（0.98±0.015）和TIMP-2 mRNA（0.97±0.029）的表達較Control組無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）。
　

32、　4、 Western blot檢測沉默Wip1后SKOV3細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達
　　Wip1-siRNA組MMP-2蛋白（0.43±0.049）和MMP-9蛋白（0.31±0.052）的表達較Control組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01）；Wip1-siRNA組TIMP-1蛋白（0.9±0.033）和TIMP-2蛋白（0.8±0.039）的表達較Control組無明顯改變