冠狀病毒N蛋白抑制IFn-β產(chǎn)生的分子機(jī)制研究.pdf

1、冠狀病毒(Coronavirus，CoV)屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科，可分為α、β、γ、δ四個(gè)屬，其中α、β冠狀病毒主要感染哺乳動物，γ-冠狀病毒主要感染鳥類，δ-冠狀病毒既可以感染鳥類，也可以感染哺乳動物。自2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）爆發(fā)以來，對冠狀病毒的研究受到高度重視。近年來，不斷有新

2、的冠狀病毒被發(fā)現(xiàn)，如2012年出現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndromecoronavirus，MERS-CoV)，2014年在美國爆發(fā)的豬δ冠狀病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV);而且，隨著環(huán)境條件變化或免疫壓力等因素的影響，一些老的冠狀病毒也發(fā)生了變異，導(dǎo)致新的變異毒株出現(xiàn)和流行，如2010年底在我國大流行的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epid

3、emic diarrhea virus，PEDV)變異毒株。這些新發(fā)與再現(xiàn)的冠狀病毒，給人類和動物健康造成構(gòu)成了巨大威脅，并且造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　核衣殼蛋白(Nucleocapsid，N)是冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是冠狀病毒編碼蛋白中表達(dá)豐度最高的蛋白，在病毒的復(fù)制與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。以前的研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV、鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)的N蛋白具有抑制Ⅰ型干擾素(Inte

4、rferon，IFN)的功能，但其作用機(jī)制不清楚。本研究對可以感染哺乳動物的三個(gè)冠狀病毒屬的代表性病毒，包括PEDV(α-CoV)、SARS-CoV和MHV(β-CoV)、PDCoV（δ-CoV）的N蛋白抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.PEDV N蛋白抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制
　　以PEDV變異毒株AJ1102株的基因組RNA為模板，克隆了N蛋白基因并構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)超表

5、達(dá)N蛋白能顯著抑制仙臺病毒(Sendai virus，SEV)誘導(dǎo)的IFN-β啟動子活性以及IFN-β mRNA和蛋白的表達(dá)，而且抑制IFN信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3以及NF-κB中的激活，提示PEDV蛋白具有拮抗IFN-β產(chǎn)生的特性。進(jìn)一步分析了誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的RLR(RIG-Ⅰ-like receptor)通路中的信號分子（RIG-Ⅰ、MDA5、IPS-1、TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3等）對N蛋白拮抗IFN-β產(chǎn)生的

6、影響，發(fā)現(xiàn)PEDV N蛋白能抑制TBK1/IKKε及其上游分子介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，但不抑制IRF3誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，推測PEDVN蛋白可能作用于RLR信號通路中的TBK1/IKKε或TBK1/IKKε與IRF3之間的信號分子。同時(shí)，還分析了PEDVN蛋白與RLR信號通路中各分子的相互作用，發(fā)現(xiàn)PEDV N蛋白僅與TBK1/IKKε存在相互作用，提示TBK1/IKKε是PEDVN蛋白的作用靶點(diǎn)。隨后的研究證實(shí)，PEDV N蛋白通過與

7、TBK1結(jié)合，導(dǎo)致TBK1與IRF3的結(jié)合能力降低，從而阻礙IRF3的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致IFN-β的產(chǎn)生受到抑制。
　　2.MHV和SARS-CoV N蛋白抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制
　　PEDV屬于α-冠狀病毒屬，而MHV和SARS-CoV屬于β-冠狀病毒屬。為了探討MHV和SARS-CoV編碼的N蛋白是否與PEDVN蛋白采用相同的機(jī)制抑制IFN-β產(chǎn)生，分析了MHV和SARS-CoV N蛋白與TBK1/IKKε的相互

8、作用，發(fā)現(xiàn)MHV和SARS-CoV的N蛋白均不與TBK1/IKKε相互作用，而且還發(fā)現(xiàn)MHV的N蛋白與以前報(bào)道的SARS-CoV的N蛋白一樣，不抑制RIG-Ⅰ和MDA5介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活，提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能作用于RIG-Ⅰ/MDA5或其上游的激活分子，與PEDVN蛋白拮抗IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制完全不同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MHV和SARS-CoV的N蛋白均不與RIG-Ⅰ/MDA5存在相互作用，但與對RIG-Ⅰ/M

9、DA5具有激活作用的dsRNA結(jié)合蛋白PACT(Protein activator of the interferon-induced proteinkinase)存在相互作用，而且還發(fā)現(xiàn)PACT可以激活RIG-Ⅰ和MDA5激活的IFN-β啟動子活性，但這種激活均能被MHV和SARS-CoV N蛋白抑制，提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能通過與PACT的相互作用從而抑制RIG-Ⅰ/MDA5的激活。隨后的分析發(fā)現(xiàn)MHV和SARS-C

10、oV的N蛋白與PACT的相互作用是依賴RNA的，MHV和SARS-CoV的N蛋白與RIG-Ⅰ/MDA5競爭性結(jié)合PACT，減弱了PACT與RIG-Ⅰ/MDA5的相互作用，從而抑制了RIG-Ⅰ/MDA5介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，是一種完全不同于PEDVN蛋白的作用機(jī)制。
　　3.PDCoV N蛋白抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制
　　PDCoV屬于新確定的δ冠狀病毒屬，也是目前δ冠狀病毒屬中唯一成功在體外分離到病毒的δ冠狀病毒。由于是一種

11、新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，目前對其免疫學(xué)特性知之甚少。為了探究PDCoVN蛋白是否也能像其他冠狀病毒的N蛋白一樣具有拮抗IFN-β產(chǎn)生的特性，我們首先用IFN-β啟動子熒光素酶系統(tǒng)、熒光定量RT-PCR以及ELISA等多種方法證實(shí)PDCoV N蛋白能夠抑制IFN-β產(chǎn)生。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)PDCoV N蛋白不能抑制RIG-Ⅰ/MDA5及其下游信號分子激活的IFN-β啟動子活性，但是能抑制SEV激活的RIG-Ⅰ和MDA5活性。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與

12、MHV和SARS-CoVN蛋白不同，PDCoVN蛋白能夠與RⅠG-Ⅰ相互作用，且相互作用區(qū)域是RIG-Ⅰ與PACT或dsRNA結(jié)合的解旋酶結(jié)構(gòu)域(Hel)和C端結(jié)構(gòu)域(CTD)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，PDCoV N蛋白與RIG-Ⅰ的相互作用導(dǎo)致RIG-Ⅰ與PACT或ploy(I∶C)的結(jié)合能力降低，從而抑制RIG-Ⅰ/MDA5的激活及下游IFN-β產(chǎn)生。更有意義的是，PDCoV N蛋白也是一種RNA結(jié)合蛋白，并且與PACT也存在相互作用。但

13、對PDCoVN基因的截短突變分析發(fā)現(xiàn)，PDCoVN蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的區(qū)域主要是其N端結(jié)構(gòu)域(NTD)，CTD不具有抑制IFN-β產(chǎn)生的功能。深入分析發(fā)現(xiàn)NTD主要負(fù)責(zé)N蛋白的胞漿定位和RIG-Ⅰ結(jié)合等功能;而CTD主要負(fù)責(zé)N蛋白核定位和RNA結(jié)合功能，這些特征對PDCoVN蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生無益。綜合上述研究結(jié)果，PDCoVN蛋白拮抗IFN-β主要是通過與RIG-Ⅰ的Hel和CTD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致RIG-Ⅰ識別或結(jié)合PACT和