豬流行性腹瀉病毒感染豬小腸上皮細(xì)胞抑制IFn-β產(chǎn)生及激活NF-κB機理研究.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是導(dǎo)致豬流行性腹瀉(PED)的致病因子，可引發(fā)嚴(yán)重腹瀉和脫水，誘發(fā)高死亡率和發(fā)病率，嚴(yán)重影響了世界各國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然該病在其分子流行病學(xué)的調(diào)查、診斷、預(yù)防及治療方面的研究已有一定的進(jìn)展，但是該病的爆發(fā)仍然呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。為了有效的控制該病的發(fā)生，有必要深入了解PEDV的分子致病機制。其中PEDV與宿主天然免疫系統(tǒng)之間的相互作用的研究可以幫助人們更好的理解PEDV感染和疾病發(fā)生的

2、分子機制。
　　PEDV感染后，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(IFN)，為PEDV逃避宿主天然免疫反應(yīng)提供了有利地條件。另外，人們發(fā)現(xiàn)病毒感染機體后可以根據(jù)自身的特性激活或抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)基因的轉(zhuǎn)錄。然而，PEDV感染不能誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN及是否激活NF-κB的具體機制仍不清楚。PEDV感染機體主要破壞豬腸道上皮組織，引起腸道充血及腸絨毛萎縮，結(jié)果導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞胞漿空泡化，脫落。因此，豬小腸上皮細(xì)胞(IECs)是PEDV感染

3、的靶細(xì)胞。為了揭示了PEDV逃避天然免疫的機制，本研究選用IECs細(xì)胞作為PEDV的感染模型，對PEDV感染IECs后天然免疫反應(yīng)信號通路進(jìn)行了較為系統(tǒng)的初步研究。
　　在病毒感染和復(fù)制時，宿主的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)是抵抗其感染的第一道防線，因此，病毒抑制或逃避該免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力在一定程度上也反應(yīng)了病毒致病力的強弱。Ⅰ型干擾素是機體免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物之一，本研究顯示PEDV感染IECs細(xì)胞不僅抑制IFN-β的產(chǎn)生，而且還抑制雙鏈RN

4、A（dsRNA）誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)和NF-κB是誘導(dǎo)IFN-β發(fā)生轉(zhuǎn)錄的兩個關(guān)鍵因子。我們發(fā)現(xiàn)PEDV感染能激活NF-κB，但不能激活I(lǐng)RF-3。此外，PEDV感染能明顯抑制dsRNA誘導(dǎo)的IRF-3的核轉(zhuǎn)位及IFN-β的產(chǎn)生。為了闡明PEDV感染抑制IRF-3激活的分子機制，我們研究了IRF-3上游的組成視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白(RIG-Ⅰ)和Toll-樣受體3(TLR3)信號通路的信號分子誘導(dǎo)IFN-β

5、的產(chǎn)生。在IRF-3的上游，我們發(fā)現(xiàn)TANK結(jié)合激酶1(TBK1)或抑制性κB激酶ε(IKKε)介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生并不受PEDV感染的影響，但是PEDV感染卻完全抑制了RIG-Ⅰ接頭分子線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)及RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，說明PEDV感染主要通過干擾RIG-Ⅰ信號通路中的MAVS的活性而抑制IFN-β的產(chǎn)生。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PEDV感染只能部分抑制TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子1(TRIF)誘導(dǎo)的IFN-β的

6、產(chǎn)生，TRIF是TLR3信號通路的組成部分。綜上表明，PEDV感染抑制IFN-β的產(chǎn)生主要是由于阻斷了RIG-Ⅰ信號通路所致。
　　NF-κB調(diào)節(jié)組成免疫系統(tǒng)的多種因子，包括多種前炎癥因子，趨化因子、黏附分子、誘導(dǎo)酶的表達(dá)及細(xì)胞的增殖。但是過度激活NF-κB將會引起炎癥及自身免疫性疾病，因此，人們常將NF-κB的激活也認(rèn)為是多數(shù)疾病感染的標(biāo)志。本研究中，我們首次報道在PEDV感染IECs細(xì)胞能激活NF-κB。在PEDV感染的細(xì)胞中

7、，NF-κB激活特征表現(xiàn)在NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核，而且增強了NF-κB調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-κB的激活隨病毒的感染進(jìn)程及劑量的增加而增強。紫外滅活的PEDV不能誘導(dǎo)NF-κB的激活。我們在PEDV感染的細(xì)胞中檢測到IκBα蛋白有降解的趨勢，這說明NF-κB的激活可能與IκBα蛋白的降解有關(guān)。為了進(jìn)一步揭示PEDV誘導(dǎo)NF-κB激活的機制，我們研究了NF-κB激活的上游信號通路，視黃酸誘導(dǎo)基因基因Ⅰ樣受體(RLRs)和TLRs信

8、號通路。通過小分子RNA干擾(siRNA)試驗，我們的研究結(jié)果表明PEDV可能通過TLRs信號通路中的接頭分子TRIF和MyD88激活NF-κB，而與RLRs相關(guān)的RIG-Ⅰ信號通路無關(guān)。我們再次通過對TLRs家族中的TLR2，TLR3，TLR4，TLR8及TLR9基因沉默，發(fā)現(xiàn)在PEDV感染的細(xì)胞中TLR2，TLR3及TLR9基因沉默后明顯抑制了NF-κB調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及NF-κB的核易位，而TLR4和TLR8基因沉默并沒有影響PED

9、V誘導(dǎo)NF-κB的激活。已經(jīng)有研究證實病毒核酸編碼的蛋白參與調(diào)節(jié)NF-κB的激活，因此，我們研究了PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白在NF-κB激活中的作用。通過NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)對PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的篩選，我們發(fā)現(xiàn)PEDV核蛋白N能夠誘導(dǎo)NF-κB的激活。同時PEDV N蛋白誘導(dǎo)NF-κB的激活具有劑量依賴性。通過激光共聚焦實驗，我們檢測到在PEDV N蛋白轉(zhuǎn)染的IECs細(xì)胞中能促進(jìn)NF-κB的核易位。此外，通過對N蛋白缺失突變體的研