豬流行性腹瀉病毒細胞培養(yǎng)適應的初步研究.pdf

1、冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。它是有包膜的單股正鏈RNA病毒，在細胞質(zhì)中復制。經(jīng)歷過2003年中國爆發(fā)的SARS，人們開始對冠狀病毒廣泛關注。2013年中東國家和地區(qū)爆發(fā)一種新型冠狀病毒MERS-CoV引起的SARS病癥，患者死亡率高達50％，再一次引起世人對冠狀病毒的廣泛關注。而PEDV屬于α類冠狀病毒，只有一個血清型。2010年

2、我國境內(nèi)爆發(fā)豬流行腹瀉病毒(下文簡稱為PEDV)，它的基因組包括ORF1a/b-S-ORF3-E-M-N，基因ORF1a/b和ORF3分別編碼復制酶多聚蛋白和附屬蛋白兩個非結(jié)構蛋白，而基因S、E、M和N分別編碼纖突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白。PEDV的細胞嗜性主要是由Spike蛋白（即S蛋白）決定的，同時S蛋白的S1區(qū)也包含了病毒主要的中和表位。PEDV的受體是pAPN，pAPN是150kDa的糖基化的跨膜蛋白，在小腸粘膜上高表

3、達。PEDV的S蛋白是高度糖基化的，含有21-35個N糖基化位點。S蛋白在病毒表面上組裝成三聚體形成明顯的“冠”。大多數(shù)研究都把S蛋白劃分成S1區(qū)和S2區(qū)，S1區(qū)域包含受體結(jié)合域(RBD)，S2區(qū)域含有兩個七肽重復區(qū)（HR1和HR2），認為S1區(qū)域負責與細胞受體結(jié)合，而S2區(qū)域負責膜融合。冠狀病毒進入細胞也有自己的一套機制，早在2003年Bosch等人就鑒定了冠狀病毒的S蛋白為Ⅰ型融合蛋白，2008年JudithM.White等人按照結(jié)

4、構的標準確定了三種明顯不同的病毒膜融合蛋白（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型融合蛋白），以及至少四種不同的激發(fā)病毒融合蛋白經(jīng)歷融合而導致構象變化的機制，總結(jié)了各種特征的病毒融合蛋白經(jīng)歷“完全融合狀態(tài)→嵌膜的同源三聚體發(fā)卡前體→三聚體發(fā)夾”的轉(zhuǎn)化，從而促進病毒膜與宿主細胞膜的融合，而冠狀病毒的S蛋白也同樣通過這種策略調(diào)節(jié)融合。PEDV的細胞培養(yǎng)比較困難，目前學界得到的PEDV細胞培養(yǎng)株只有7株，而且這些毒株適應Vero細胞的分子基礎尚不得而知，一些初步的研究

5、結(jié)果提示S基因堿基或氨基酸的突變可能是潛在的PEDV適應細胞的關鍵分子基礎。2013年，我們課題組與荷蘭烏德勒支大學獸醫(yī)學院合作，利用PEDV與MHV間S基因胞外區(qū)的替換，成功構建了基于RNATargetedrecombination方法的PEDV反向遺傳學操作平臺，為本課題的順利實施奠定了堅實的基礎。因此，本論文利用該操作系統(tǒng)，用DR13毒株非細胞適應株(Genbank:JQ023161)的S基因，分別逐段替換DR13細胞適應株(Ge