IFN-λ與丙型肝炎患者應(yīng)用IFN-α抗病毒治療療效的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染可引起肝臟急慢性炎癥，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有1.8億人感染HCV，其中約有4250萬感染者在中國。約有20％-30％的HCV感染者在急性期可以自發(fā)清除病毒，而大部分HCV感染者轉(zhuǎn)化為慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC），其中30％ CHC患者可進(jìn)展為肝硬化，而且CHC患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的機(jī)會(huì)為正常人的20-30倍。因此CHC已成為值得關(guān)注的

2、全球性公眾健康問題，迫切需要有效的抗病毒治療方案。干擾素(interferon，IFN)是機(jī)體細(xì)胞在受到某些病毒感染后所分泌的一類特異性細(xì)胞因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活性，根據(jù)IFN的氨基酸序列和生物學(xué)活性可分為三類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型INF包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、 IFN-δ和IFN-ζ等，其中IFN-α為臨床上應(yīng)用比較廣泛的抗病毒藥物之一;Ⅱ型INF僅有1種為IFN-γ;Ⅲ型INF

3、即IFN-λ，包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。目前標(biāo)準(zhǔn)的抗HCV治療方案為聚乙二醇化干擾素-α(pegylated interferonα，PEG-IFN-α)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)，治療4周時(shí)HCV-RNA轉(zhuǎn)陰(HCV-RNA＜1000IU/ml)為快速病毒學(xué)應(yīng)答(rapidvirologic response，RVR)，若治療治療4周時(shí)HCV-RNA仍為

4、陽性至治療12周時(shí)HCV-RNA轉(zhuǎn)陰(HCV-RNA＜1000IU/ml)為早期病毒學(xué)應(yīng)答(eralyvirologic response，EVR)。已有研究證實(shí)RVR和EVR能很好的預(yù)測持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)即治療結(jié)束24周HCV-RNA小于1000IU/ml，其中獲得RVR的患者約88％-100％可獲得SVR，一旦達(dá)到SVR，99％以上可以維持病毒學(xué)應(yīng)答5年甚至更久。但

5、并不是所有丙型肝炎患者都可以獲得滿意的抗病毒療效，影響抗病毒療效的因素有病毒因素（如HCV基因型、基線病毒載量等）、藥物因素（如IFN-α種類、IFN-α和RBV有明顯的血液學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)抑制等不良反應(yīng)、IFN-α藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)等）、宿主因素[如對(duì)IFN-α耐受性不佳、免疫應(yīng)答狀態(tài)、IL-28B單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotide polyorphism，SNP)等]。
　　近幾年一系列全基因組關(guān)聯(lián)分析研究報(bào)道了丙

6、型肝炎患者的IL-28BSNP不同位點(diǎn)的基因型(rs12979860、rs8099917、rs12980275)與抗病毒治療應(yīng)答密切相關(guān)，攜帶保護(hù)性基因型的丙型肝炎患者自發(fā)清除病毒、獲得SVR的機(jī)率比攜帶非保護(hù)基因型的患者高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶保護(hù)性基因型的丙型肝炎患者血清中的IL-29、IL-28A、IL-28B水平和外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的IL-29 mRNA

7、、IL-28AmRNA、IL-28B mRNA水平均高于攜帶非保護(hù)性基因型的患者，丙型肝炎患者血清中IL-29水平低于正常人、而IL-28A水平高于正常人，丙型肝炎患者肝組織中IL-28A mRNA和IL-29 mRNA的表達(dá)高于正常人。已有研究證實(shí)，IFN-λ與IFN-α的結(jié)合受體及分布不同，但它們可以通過相同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，傳導(dǎo)活化信號(hào)、誘導(dǎo)一系列干擾素激活基因的表達(dá)，IFN-λ與IFN-α可協(xié)同發(fā)揮抗病毒作用。上述研究表明，丙型肝

8、炎患者IL-28B SNP與抗病毒治療療效密切相關(guān)，丙型肝炎患者體內(nèi)IFN-λ水平與抗病毒治療療效可能有相關(guān)性。
　　已有研究證實(shí)，RV和EVR可以很好的預(yù)測SVR，其中RVR能更好的預(yù)測SVR，本研究根據(jù)患者應(yīng)用IFN-α治療4周時(shí)HCV-RNA是否轉(zhuǎn)陰分為快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)組和非快速病毒學(xué)應(yīng)答(N-RVR)組，旨在探討丙型肝炎患者體內(nèi)IL-28B rs12979860基因型、IFN-λ水平與其應(yīng)用IFN-α抗病毒治療獲得

9、RVR是否有相關(guān)性及其臨床意義。
　　方法:選取丙型病毒性肝炎患者45例，根據(jù)患者應(yīng)用IFN-α治療4周時(shí)HCV-RNA是否轉(zhuǎn)陰(HCV-RNA＜1000IU/ml)分為快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)組21例和非快速病毒學(xué)應(yīng)答組(N-RVR)組24例，另外設(shè)健康對(duì)照組(Normal)組15例。
　　1病毒學(xué)指標(biāo)檢測:應(yīng)用微粒子酶聯(lián)免疫法檢測抗-HCV，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測HCV-RNA水平。
　　2收集血清，應(yīng)用E

10、LISA法檢測血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平。
　　3收集新鮮外周抗凝血，用密度梯度離心法分離收集PBMCs: Trizol法抽提提取PBMCs中的總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平;提取PBMC中總蛋白，應(yīng)用Western blot法檢測外周血PBMC中IL-29、IL-28A和IL28B蛋白表達(dá)水平。
　　4留取丙型肝炎患者外周(含

11、EDTA)抗凝全血，提取DNA，應(yīng)用TapMan MGB蛋白探針法檢測IL-28B rs12979860基因型。
　　結(jié)果:
　　1血清中IL-29、IL-28A和IL-28B的表達(dá)水平
　　1.1健康對(duì)照組血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平分別為(11.78±0.78)、(268.13±9.82)、(267.26±8.26)。
　　1.2丙型肝炎患者在干擾素-α治療前（0周）血清中IL-29、I

12、L-28A、IL-28B的水平:RV組分別為(13.32±1.34)、(273.11±8.78)、(293.67±7.38); N-RVR組分別為(10.58±1.44)、(243.05±9.48)、(254.85±8.67)。
　　1.3丙型肝炎患者在干擾素-α治療4周時(shí)血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平:RVR組分別為(12.90±1.04)、(288.49±13.50)、(308.53±9.48); N-RV

13、R組分別為(10.14±0.46)、(253.53±4.37)、(247.34±6.39)。
　　采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上結(jié)果得出:RVR組血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平在治療前、治療4周時(shí)均明顯高于N-RVR組，P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table1);而健康對(duì)照組處于RVR組和N-RVR組之間，其中IL-28B的水平明顯低于RVR組、高于N-RVR組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab

14、le1);丙型肝炎患者在干擾素-α治療前與治療4周血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平變化不大。
　　2將PBMCs中GAPDH的表達(dá)量設(shè)定為1.00，與GAPDH表達(dá)量相比，得出IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA相對(duì)表達(dá)水平
　　2.1健康對(duì)照組PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表達(dá)水平分別為(0.76±0.02)、(0.68±0.02)、(0.70±0.02)。

15、>　　2.2丙型肝炎患者在干擾素-α治療前(0周)PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表達(dá)水平:RVR組分別為(0.80±0.02)、(0.79±0.02)、(0.72±0.02);N-RVR組分別為(0.71±0.02)、(0.65±0.02)、(0.68±0.01)。
　　2.3丙型肝炎患者在干擾素-α治療4周時(shí)PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表達(dá)水平:RVR組分別為(0.8

16、0±0.02)、(0.79±0.01)、(0.74±0.02);N-RVR組分別為(0.70±0.01)、(0.64±0.01)、(0.66±0.01)。
　　采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上結(jié)果得出:RVR組PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表達(dá)水平在治療前、治療4周時(shí)均明顯高于N-RVR組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table2);而健康對(duì)照組處于RV組和N-RVR組之間，其中IL-28A

17、的mRNA表達(dá)水平低于RVR組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table2);丙型肝炎患者在干擾素-α治療前與治療4周PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表達(dá)水平變化不大。
　　3將PBMC中內(nèi)參β-actin相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00，與β-actin表達(dá)量相比較，得出IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表達(dá)水平:
　　3.1健康對(duì)照組PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表

18、達(dá)水平分別為(0.67±0.12)、(0.58±0.13)、(0.70±0.11)。
　　3.2丙型肝炎患者在干擾素-α治療前（0周）PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表達(dá)水平:RVR組分別為(0.73±0.01)、(0.69±0.03)、（0.73±0.03）;N-RVR組分別為(0.52±0.02)、(0.48±0.03)、(0.53±0.03)。
　　3.3丙型肝炎患者在干擾素-α治療4周時(shí)PBMC

19、中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表達(dá)水平:RVR組分別為(0.73±0.09)、(0.70±0.11)、（0.77±0.09）;N-RVR組分別為(0.55±0.09)、(0.50±0.10)、(0.57±0.09)。
　　采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上結(jié)果得出:RVR組PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白表達(dá)水平在治療前、治療4周時(shí)均明顯高于N-RVR組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見

20、Table3）;丙型肝炎患者在干擾素-α治療前與治療4周PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表達(dá)水平變化不大。
　　4 IL-28B rs12979860 CC型丙型肝炎患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B水平明顯高于CT和TT型患者，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CT型患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B水平介于CC和TT型患者之間，其中血清中IL-28B水平明顯高

21、于TT型患者，PBMC中IL-28A mRNA水平明顯高于TT型患者，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見Table4/5/6）。
　　5 Pearson卡方相關(guān)分析法分析三種IL-28B rs12979860基因型與RVR率的關(guān)系，結(jié)果:IL-28B rs12979860 CC基因型攜帶者獲得RVR率明顯高于CT、TT基因型攜帶者（見Table7）。
　　6將丙型肝炎患者HCV-RNA基線水平、HCV分型、IL-28B rs

22、12979860基因型、PBMC和血清中IL-29、IL-28A、IL-28B水平等多種因素與IFN-α抗病毒應(yīng)答療效進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析(Table8);
　　6.1通過向后逐步排除法，進(jìn)入回歸方程的自變量為X3、X6、X12;卡方檢驗(yàn)，x2=32.183， P＜0.01，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　回歸方程:logitP=-2.76+2.94 X3+3.30X6+6.58X12。
　　6.2 X3、X6、X

23、12的logistic回歸系數(shù)反應(yīng)對(duì)RVR/N-RVR的影響:
　　IL28B CC基因型對(duì)獲得RVR的優(yōu)勢比(OR)為5.06;PBMC中IL28B mRNA水平每增加一個(gè)等級(jí)對(duì)獲得RVR的優(yōu)勢比為6.28; PBMC中IL28B蛋白水平每增加一個(gè)等級(jí)對(duì)獲得RVR的優(yōu)勢比為13.87。
　　結(jié)論:
　　1丙型肝炎患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平與RVR密切相關(guān)。
　　2 IL-2