雞腺胃炎病原的分離及Real-time PCR檢測(cè)IBV在各器官的表達(dá).pdf

1、2011-2012年肉雞和蛋雞腺胃炎發(fā)病率較高，該病在中國(guó)大部分省份均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)對(duì)該病檢測(cè)方法的研究，對(duì)控制傳染性病毒性腺胃炎病的發(fā)生，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。自腺胃炎發(fā)生以來(lái)，關(guān)于腺胃炎的病因仍然眾說(shuō)紛紜，本研究在臨床上遇到的傳染性病毒性腺胃炎病例中分離出了傳染性支氣管炎病毒(IBV)。不同發(fā)病程度的患病雞的剖檢變化不同，對(duì)于病因不詳?shù)牟《拘约膊?，弄清楚病毒侵害的主要靶器官?duì)于該病

2、的預(yù)防和治療起著至關(guān)重要的作用。因此筆者應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)患病雞的胸腺、肺臟、心臟、腺胃、腎臟、肝臟、腦等器官中病毒的含量做定量分析并進(jìn)行差異顯著性分析。
　　 將連續(xù)盲傳八代的尿囊液進(jìn)行直接血凝試驗(yàn)，病毒無(wú)血凝性，用1％磷脂酶C處理后有血凝性。也通過(guò)對(duì)NDV的干擾實(shí)驗(yàn)及RTPCR實(shí)驗(yàn)初步鑒定該病毒為傳染性支氣管炎病毒。首先針對(duì)IBV-N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出216bp的目的片段，

3、同時(shí)參照已往發(fā)表的文獻(xiàn)合成一對(duì)擴(kuò)增內(nèi)參基因的-β-actin引物，大小為139bp。將這兩個(gè)擴(kuò)增的目的片段分別與pEASY-T1 Cloning Vector重組，將重組質(zhì)粒分別命名為pEASY-T1-N和pEASY-T1-β-actin。將兩個(gè)重組質(zhì)粒酶切鑒定、測(cè)序成功后作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)-系R2值為0.9972和0.9983，相關(guān)性極好，檢測(cè)極限為1.0 E+02拷貝。

4、　　 對(duì)腺胃炎病例各器官進(jìn)行RNA的提取，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，將測(cè)得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出N基因和β-actin基因的拷貝數(shù)，然后根據(jù)公式:IBV-N相對(duì)表達(dá)量=IBV-N拷貝數(shù)/β-actin拷貝數(shù)計(jì)算IBV-N的相對(duì)含量。用已建立的方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示腺胃中病毒的相對(duì)含量最高;腎臟次之，與肺臟差異不顯著，與其他器官差異顯著，肺臟居第三，與肝臟、腎臟差異不顯著，與其他器官具有顯著性差異。肝臟居第四，與