應(yīng)用Real-time RT-PCR進(jìn)行胃癌腹膜亞臨床轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè).pdf

1、胃癌在我國(guó)具有很高的發(fā)病率，死亡率居惡性腫瘤之首。胃癌的主要治療手段是根治手術(shù)，術(shù)后5年生存率約為40％，其中約30％～50％的患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。腹膜轉(zhuǎn)移病灶一旦形成，即為臨床轉(zhuǎn)移，治療則陷入十分困難的境地。 胃癌細(xì)胞脫落入腹腔后，其在腹腔內(nèi)的生物學(xué)活動(dòng)導(dǎo)致許多特異性分子標(biāo)志物的產(chǎn)生，因此能夠檢測(cè)到這些特異性分子標(biāo)志物的存在就證明了腹腔中脫落腫瘤細(xì)胞的存在。我們利用各種分子生物學(xué)方法在胃癌患者的腹腔沖洗

2、液中檢測(cè)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)并能敏感表達(dá)的特異性分子標(biāo)志物，以期提高脫落腫瘤細(xì)胞的檢出率。但是，目前各種研究結(jié)果并不一致，哪種指標(biāo)能夠做為良好的檢測(cè)標(biāo)志物來(lái)切實(shí)有效的提高脫落腫瘤細(xì)胞的檢出率，尚無(wú)法達(dá)成共識(shí)。近年來(lái)隨著實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)的應(yīng)用，能夠?qū)崟r(shí)定量檢測(cè)到微量的mRNA，因而能夠更準(zhǔn)確的反映腹腔游離癌細(xì)胞的存在。 本研究選取與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的8種分子生物學(xué)標(biāo)志物，應(yīng)用Real-

3、Time RT-PCR方法對(duì)115例胃癌患者的腹腔沖洗液進(jìn)行檢測(cè)，另選取10例良性疾病患者的腹腔沖洗液作為陰性對(duì)照，對(duì)上述標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，以期找出能夠提高脫落腫瘤細(xì)胞檢出率的指標(biāo)，用以指導(dǎo)臨床的診斷治療。 材料與方法： 一、標(biāo)本采集 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科2007～2008年間胃癌患者腹腔沖洗液115例。 二、實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)腹腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查(PLC)診斷結(jié)果分組為：PLC(—)組

4、、PLC(+)組、PLC(±)組及良性疾病腹腔沖洗液對(duì)照組。 三、提取腹腔沖洗液總RNA TRIZOL法提取胃癌腹腔沖洗液標(biāo)本中的總RNA，取少量RNA用于含量及純度測(cè)定，其余分裝后置—80℃保存待用。 四、 Real-Time RT-PCR擴(kuò)增各目的基因mRNA (一)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 (二)Real-Time RT-PCR擴(kuò)增各個(gè)分子指標(biāo)，以β—actin做內(nèi)對(duì)照

5、。 (三)Rotor—Gene3000實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)分析各基因表達(dá)情況。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件SPSS13.0分析，選用X2檢驗(yàn)、方差分析、Mann—Whitney檢驗(yàn)及Kruskal—Wallis檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果： 一、PLC檢查結(jié)果及分組 PLC(一)組：66例，57.3％(66/115)；PLC(+)組：31例，27.0％(31/115)；PLC(±)組：1

6、8例，15.7％(18/115)。 二、Real-Time RT-PCR檢測(cè)腹腔沖洗液中各指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性率 CEA：39.1％(45/115)；DDC：34.8％(40/115)；HPA：33.0％(38/115)：MMP—7：31.3％(36/115)；Ki—67：30.4％(35/115)；TGF-β1：28.7％(33/115)；PCNA：25.2％(29/115)；L—3-PP：24.3％(28/115)。

7、 三、ROC曲線分析各目的基因診斷價(jià)值 通過(guò)比較各指標(biāo)ROC曲線下面積，各基因診斷價(jià)值順序如下：CEA>DDC>HPA> MMP—7>Ki—67>TGF-β1>PCNA>L—3-PP。 四、各目的基因表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較 PLC結(jié)果陽(yáng)性的31例病例中，各指標(biāo)的陽(yáng)性率依次為CEA93.5％(29/31)、DDC90.3％(28/31)、HPA87.1％(27/31)、MMP—777.4％(24

8、/31)、Ki—6771.0％(22/31)、TGF-β161.3％(19/31)、PCNA54.8％(17/31)和L—3-PP45.2％(14/31)。其中CEA、DDC、HPA的表達(dá)陽(yáng)性率要明顯高于其他5種標(biāo)志物(P<0.05)，顯示了良好的敏感性。 肉眼腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的14例病例中，各指標(biāo)的陽(yáng)性率依次為CEA100％(14/14)、DDC100％(14/14)、HPA92.9％(13/14)、MMP—778.6％(11/1

9、4)、Ki—6771.4％(10/14)、TGF-Pi64.3％(9/14)、PCNA64.3％(9/14)和L—3-PP57.1％(8/14)。其中CEA、DDC、HPA、MMP—7的表達(dá)陽(yáng)性率要明顯高于其他4種標(biāo)志物(P<0.05)，顯示了良好的敏感性。 CEA、DDC及HPA的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、漿膜類型、胃癌生長(zhǎng)方式及胃癌的大體類型相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論： (1)CEA、DDC、HPA作為胃癌腹