人細(xì)小病毒B19 Real-time PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、入細(xì)小病毒B19(human parvovirus B19)屬于細(xì)小病毒科紅病毒屬，是20nm-26nm的二十面體無(wú)包膜病毒，一般通過(guò)呼吸道進(jìn)行傳播，也可經(jīng)輸血、血液制品以及血-胎途徑垂直傳播。B19在發(fā)現(xiàn)新的病毒PARV4、PARV5和博卡病毒(human bocavirus)之前被認(rèn)為是細(xì)小病毒屬中唯一對(duì)人類有致病性的病原體[1-3]，可引起兒童的傳染性紅斑（第五?。?，在成人中可引起關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病，感染孕婦可造成胎兒水腫及胎兒先天性

2、貧血，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致胎兒死亡，對(duì)免疫缺陷患者會(huì)導(dǎo)致慢性貧血，短暫的再生障礙性危象等嚴(yán)重疾病，因此建立人細(xì)小病毒B19的檢測(cè)方法十分必要。
　　 目前針對(duì)細(xì)小病毒B19的檢測(cè)方法主要有血清學(xué)檢測(cè)和PCR檢測(cè)，分別針對(duì)血清中存在抗體和病原核酸進(jìn)行檢測(cè)。B19的PCR檢測(cè)方法主要包括：普通PCR，巢氏PCR和熒光定量PCR(Real-time PCR)等，Real-time PCR檢測(cè)方法由于其靈敏度高，特異性好，定量準(zhǔn)確，并且具有實(shí)時(shí)

3、監(jiān)測(cè)和高通量的優(yōu)勢(shì)，是B19核酸檢測(cè)的重要工具。如果在核酸提取體系中加入了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照，競(jìng)爭(zhēng)PCR則能夠有效控制核酸提取和PCR擴(kuò)增效率的差異，有利于排除假陰性結(jié)果。
　　 本研究首先建立了添加內(nèi)對(duì)照的B19 DNA Real-time PCR檢測(cè)方法；利用該方法檢測(cè)人血清，獲得了兩個(gè)B19核酸陽(yáng)性樣本；然后設(shè)計(jì)了多套引物，使用巢氏PCR從一份陽(yáng)性核酸中克隆除長(zhǎng)末端(LTR)以外的B19全長(zhǎng)序列，將PCR得到的基因片段連接到pM

4、D18-T載體上，再使用預(yù)先設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)將所有片段連接起來(lái)得到B19的基因組。
　　 一、人細(xì)小病毒B19 Real-time PCR檢測(cè)方法的建立。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航⒃O(shè)有競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照的TaqMan探針Real-time PCR檢測(cè)人細(xì)小病毒B19的方法，用于血清樣本的檢測(cè)。方法：首先確定血清中病毒核酸的提取方法，比較幾種試劑盒的核酸提取效率，選擇核酸獲得率較高的一種;根據(jù)B19序列以及Real-time PCR

5、要檢測(cè)的序列設(shè)計(jì)四條引物，重疊延伸PCR(overlapextension PCR)方法合成B19-113片段，末端加A后連接至pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-B19-113作為標(biāo)準(zhǔn)DNA并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用相同方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-B19CT作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照（競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的區(qū)別僅在于探針結(jié)合序列不同），同樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定血清核酸提取時(shí)內(nèi)對(duì)照的添加量，建立Real-time PCR檢測(cè)細(xì)小病毒B19

6、的方法，使用建立好的方法進(jìn)行血清標(biāo)本檢測(cè)。結(jié)果：確定了血清中病毒核酸的提取方法，分別成功構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒，建立了Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和人血清細(xì)小病毒B19 Real-timePCR檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)1000geq/ml(genome equivalents per mL)血清；對(duì)160份血清樣本進(jìn)行了篩選，得到了2份B19陽(yáng)性標(biāo)本。結(jié)論：建立了人細(xì)小病毒B19熒光定量PCR檢測(cè)方法，可以用于人血清B19的檢測(cè)。
　

7、　 二、B19基因組的克隆。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍侄慰寺19基因組序列，并將其拼接成完整的病毒基因組。方法：參考GenBank發(fā)表的B19基因組序列，依據(jù)單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（共選擇了6個(gè)位點(diǎn)），將全長(zhǎng)基因組分為7段；設(shè)計(jì)7套巢式PCR引物，以B19陽(yáng)性核酸（編號(hào)N105）為模板，使用巢氏PCR擴(kuò)增7段B19基因序列；先將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，進(jìn)行序列測(cè)定；然后利用選定的限制性內(nèi)切酶將克