肺炎衣原體感染的診斷及其應(yīng)用.pdf

1、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病原微生物，自從上個(gè)世紀(jì)80年代中期正式命名以來(lái)得到了研究者們的廣泛重視。所致疾病最常見的是肺炎和支氣管炎，近年來(lái)諸多研究表明其與動(dòng)脈粥樣硬化綜合癥，老年癡呆癥等疾病有關(guān)。Cpn分布極其廣泛，大約有50．80％的成人血清可檢出抗體。在我國(guó)，與Cpn感染相關(guān)的疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。目前檢測(cè)Cpn的多種方法均存在一定的不足之處。因此，我們?cè)囃ㄟ^(guò)制

2、備針對(duì)Cpn的單克隆抗體(Monoclonal Antibody，McAb)，建立直接免疫熒光法(DirectImmunofluorescence Assay，DIF)，同時(shí)應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)與核酸雜交(Southem Blotting)方法，檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)中Cpn抗原和核酸。通過(guò)對(duì)以上檢測(cè)

3、結(jié)果的比較，較客觀的評(píng)定每種方法的特異性和敏感性，以便用于輔助Cpn感染的臨床診斷，分析Cpn感染與疾病的因果關(guān)系。 論文第一部分主要內(nèi)容是，以進(jìn)口Cpn抗原免疫BALB/C小鼠，將免疫的小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，并用間接酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoadSorbent Assay，ELISA)篩選抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的融合率為61.46％(236/384)。經(jīng)

4、克隆化及篩選后，最終獲得4株穩(wěn)定分泌CpnMcAb的細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞接種小鼠后，收集小鼠腹水McAb，經(jīng)純化后用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，效價(jià)高者可達(dá)1：10<'6>；免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定McAb為IgG類；微量熒光免疫試驗(yàn)(Micro-immunofluorescenceAssay,MIF)檢測(cè)McAb種屬特異性發(fā)現(xiàn)，與鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cps)出現(xiàn)一定程度的交叉反應(yīng)，而與沙眼衣原體(Chlamy

5、dia trachomatis，Ct)則無(wú)交叉反應(yīng)，此結(jié)果與進(jìn)口Cpn MeAb一致。Dot-ELISA顯示獲得的單抗與39.5KD克隆表達(dá)的重組Cpn主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein，MOMP)呈陽(yáng)性結(jié)合反應(yīng)，為Cpn MOMP特異性McAb。 論文第二部分是以FITC自行標(biāo)記自制Cpn McAb，其熒光素與蛋白的比值(F/P)為2.28，成功獲得熒光素標(biāo)記的MeAb。用自制Cpn MeA

6、b與進(jìn)口CpnMcAb，建立了直接免疫熒光法(DIF)。用DIF同時(shí)檢測(cè)240份PBMC標(biāo)本的Cpn抗原，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示，兩種McAb檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性的共86份，SPSS軟件分析自制Cpn McAb的特異性和敏感性均與進(jìn)口McAb具有中等一致性?？捎米灾芃cAb替代進(jìn)E1 McAb檢測(cè)Cpn抗原，以輔助Cpn感染的臨床診斷。與進(jìn)口McAb相比，自制MeAb同樣具有敏感性和特異性，且有方便、價(jià)廉的特點(diǎn)。以自制Cpn McAb對(duì)動(dòng)脈

7、粥樣硬化等心血管疾病和某些呼吸道疾病組標(biāo)本作Cpn抗原檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率分別為69.34％(95/137)和72.06％(49/68)，分別與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)均具顯著性差異。提示對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化等某些疾病的發(fā)生和發(fā)展，Cpn感染可能是重要的原因之一，但其中的因果關(guān)系還有待深入研究。 論文第三部分通過(guò)設(shè)計(jì)Cpn特異性雙引物，建立了巢式PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了相關(guān)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)具有很好的特異性和敏感性。在對(duì)240份

8、PBMC標(biāo)本進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)中，呈陽(yáng)性的有74.17％(178/40)，比DIF的陽(yáng)性檢出率略高，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，呼吸道疾病PBMC標(biāo)本中，巢式PCR的陽(yáng)性檢出率為79.41％(54/68)，心血管疾病PBMC標(biāo)本的則為75.18％(103/137)。通過(guò)Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)巢式PCR第二步擴(kuò)增產(chǎn)物，設(shè)計(jì)特異性DIG標(biāo)記探針，建立了核酸雜交(Southem BloWing)試驗(yàn)，對(duì)24份巢式PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)

9、，陽(yáng)性符合率為100％，更進(jìn)一步確證巢式PCR擴(kuò)增的是特異性Cpn核酸。 本課題通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備并獲得了4株穩(wěn)定分泌特異性Cpn McAb的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定為On MOMP特異性McAb；建立了DIF、巢式PCR及核酸雜交試驗(yàn)，用這3種方法對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不僅具有良好的相符性，亦具有較好的敏感性和特異性，均可用于輔助Cpn感染的的臨床診斷，尤其是自制McAb還具有方便、價(jià)廉的特點(diǎn)；選用心血管和呼吸系統(tǒng)疾病患者的