Ⅰ型鴨肝炎病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及其在臨床上的初步應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus，DHV）引起的一種急性、高度致死性的傳染病，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展影響極大。鴨肝炎病毒分為三個(gè)型，其中，Ⅰ型鴨肝炎病毒屬于小RNA病毒科，沒(méi)有囊膜。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是利用特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、反應(yīng)快速等優(yōu)

2、點(diǎn)，已在許多疾病的檢測(cè)中得到應(yīng)用。
　　基于此，本實(shí)驗(yàn)采用LAMP技術(shù)建立了一種Ⅰ型鴨肝炎病毒檢測(cè)方法，并成功將其應(yīng)用于鴨泄殖腔中鴨肝炎病毒的檢測(cè)。為該病的診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　首先，參考GenBank中已發(fā)表的Ⅰ型鴨肝炎病毒全部基因序列，利用BLAST和DNAstar等軟件對(duì)生物信息學(xué)比對(duì)分析，得出一種能夠編碼RNA聚合酶的3D基因序列最為保守，因此將其選作本實(shí)驗(yàn)的靶序列。運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出多組

3、LAMP引物。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)成功篩選出一組可用于檢測(cè)的引物組。
　　其次，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系（Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、酶濃度、引物濃度）和反應(yīng)條件（時(shí)間、溫度）的逐一優(yōu)化，建立并完善了Ⅰ型鴨肝炎病毒LAMP檢測(cè)方法。以PCR方法為對(duì)照，分析了LAMP法檢測(cè)Ⅰ型鴨肝炎病毒的靈敏度:LAMP法的最低檢測(cè)限可達(dá)10fg,高于PCR法兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這有利于對(duì)低病毒含量的組織病料進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)以Ⅰ型鴨肝炎病毒核酸作為陽(yáng)性樣品

4、，其他常見(jiàn)鴨病原體（Ⅱ型鴨肝炎病毒、Ⅲ型鴨肝炎病毒、番鴨呼腸孤病毒、新城疫病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒）的核酸和DEPC水作為陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品有白色沉淀產(chǎn)生，而陰性樣品無(wú)變化，提示該方法特異性良好。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程是在63℃水浴鍋中恒溫孵育45min，然后將其轉(zhuǎn)入80℃水浴鍋中終止反應(yīng)5min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管有無(wú)白色沉淀直接判定。
　　最后，利用本實(shí)驗(yàn)建立的Ⅰ型鴨肝炎病毒LAMP檢