分子診斷技術(shù)平臺(tái)的建立及其在呼吸道病毒與登革病毒檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　1.整合以核酸擴(kuò)增為原理的各種PCR技術(shù)(普通PCR、熒光定量PCR、多重PCR)和高通量基因測(cè)序技術(shù)，建立既能快速篩查常見病毒，又有能力發(fā)現(xiàn)新發(fā)病毒的臨床病毒檢測(cè)體系，滿足醫(yī)療機(jī)構(gòu)用于常規(guī)檢驗(yàn)工作和公共衛(wèi)生單位應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的需求。
　　2.建立常見呼吸道病毒篩查的多重PCR、病毒宏基因組學(xué)高通量基因測(cè)序平臺(tái)、腺病毒核酸通用及分型PCR檢測(cè)體系，探討其在呼吸系統(tǒng)感染病原學(xué)診斷上的應(yīng)用。
　　3.基

2、于2014年廣州發(fā)生的嚴(yán)重登革熱疫情，自主建立登革病毒核酸檢測(cè)及分型技術(shù)體系，分析本次疫情流行的登革病毒型別和基因進(jìn)化特征、住院患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，以了解本次疫情的流行病學(xué)特征;比較分子診斷技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)在登革熱臨床診斷中的應(yīng)用效果，以指導(dǎo)臨床合理選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目。
　　方法:
　　1.呼吸道病毒分子診斷平臺(tái)的建立及應(yīng)用
　　1.1呼吸道病毒多重PCR檢測(cè)體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究
　　設(shè)計(jì)

3、一套針對(duì)A型流感病毒(IFA)、B型流感病毒(IFB)、1～4型人副流感病毒(HPⅣ)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒(ADV)，鼻病毒(RV)，腸道病毒(EV)，人偏肺病毒(HMPV)，人博卡病毒(HBoV)，冠狀病毒OC43(OC43)，冠狀病毒NL63(CoronavirusNL63)，冠狀病毒229E(Coronavirus229E)共15種常見呼吸道病毒的多重PCR檢測(cè)體系，對(duì)259份兒科門診急性鼻竇炎(ARS)患兒、219

4、份急性上呼吸道感染(AURI)患兒、86份對(duì)照兒童鼻拭子標(biāo)本進(jìn)行呼吸道病毒檢測(cè)。比較分析ARS組和AURI組患兒鼻部的呼吸道病毒分布情況，分析與急性鼻竇炎的相關(guān)性最高的病毒。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡方檢驗(yàn)。
　　1.2呼吸道宏基因組高通量測(cè)序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究
　　建立基于Ion Torrent/Proton平臺(tái)的呼吸道宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)，并對(duì)9份重癥肺炎患兒肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本進(jìn)行宏基因組測(cè)序。獲得的測(cè)

5、序讀長(zhǎng)用BLASTn與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析標(biāo)本中存在的病毒種類及豐度，對(duì)標(biāo)本中微生物的種類進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。數(shù)據(jù)量足夠時(shí)使用Trinity軟件組裝病毒的全基因組序列，使用TVC和GATK兩種方法進(jìn)行SNPs及InDel突變的檢測(cè)，使用BioEdit7.0和MEGA6.0軟件進(jìn)一步做毒株的同源進(jìn)化分析。并比較NGS技術(shù)與PCR擴(kuò)增和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定結(jié)果的一致性。
　　1.3腺病毒通用及分型PCR檢測(cè)方法的

6、建立及各亞型流行特征的研究
　　設(shè)計(jì)針對(duì)腺病毒Hexon基因保守區(qū)的通用引物、探針以及3、4、7、14、21型腺病毒型特異性引物，建立人腺病毒檢測(cè)及分型的普通PCR和熒光定量PCR方法，對(duì)105份腺病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的兒童呼吸道感染標(biāo)本進(jìn)行基因分型，分析腺病毒各亞型在兒童呼吸道感染疾病中的分布情況。
　　2.登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評(píng)估
　　2.1登革病毒PCR檢測(cè)體系的建立及廣州登革疫情的流行病學(xué)研究
　　設(shè)計(jì)

7、1～4型登革病毒通用及型特異性的普通PCR和熒光定量PCR引物、探針，建立登革病毒核酸檢測(cè)及分型體系。并對(duì)2014年9月20日至2014年11年20日間于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的登革熱住院患者的血清標(biāo)本進(jìn)行登革病毒檢測(cè)及分型，對(duì)病毒分離株的E、NS1基因序列做進(jìn)化分析，開展登革病毒分子流行病學(xué)研究。
　　2.2登革熱分子診斷與免疫學(xué)檢驗(yàn)方法的比較
　　根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集138名登革熱確診住院患者的254份血清樣本

8、，并進(jìn)行病毒核酸（熒光定量PCR技術(shù)）和登革病毒NS1抗原(ELISA)、特異性抗體（層析免疫分析法）檢測(cè)。對(duì)診斷登革熱的分子生物學(xué)與免疫學(xué)方法進(jìn)行比較，觀察不同檢測(cè)指標(biāo)在病程中的變化規(guī)律，為合理使用登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷項(xiàng)目提供依據(jù)。
　　2.32014年廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗(yàn)結(jié)果的分析
　　收集138名登革熱住院患者的臨床資料，按照其感染的登革病毒血清型、發(fā)病程度（普通或重癥登革熱）進(jìn)行分組，比較不同組間皮疹、肌肉痛

9、、惡心嘔吐、腹痛腹瀉等癥狀，白細(xì)胞、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等多項(xiàng)臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的差異及其在發(fā)病期間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。
　　成果:
　　1.呼吸道病毒分子診斷整合平臺(tái)的建立及應(yīng)用
　　1.1呼吸道病毒多重PCR檢測(cè)體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究
　　使用呼吸道多重PCR篩查體系從564份鼻拭子標(biāo)本中檢出179株(31.7％)病毒，ARS組(44.4％)、AURI組(27.4％)和對(duì)

10、照組(4.7％)各組之間病毒檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，RR=2.116，95％CI=1.440～3.110)。RV的檢出率最高，在ARS組中有24例(9.3％)，AURI組中9例(4.1％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，RR=2.27);另外ARS組檢出腺病毒16例(6.2％)，AURI組4例(1.6％)(P＜0.05，RR=3.374)，其余病毒在兩組之間的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　1.2呼吸道宏基因組高通量

11、基因測(cè)序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究
　　成功利用呼吸道宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)重癥肺炎患者BALF標(biāo)本進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果顯示每份標(biāo)本中病毒、真菌、細(xì)菌的讀長(zhǎng)序列所占比例各不相同。檢測(cè)出的主要病原體有7例ADV-7，其中一例是ADV-7和HPⅣ混合感染，MPV和H3N2甲型流感病毒各1例，同時(shí)共存有多種低豐度的其他病毒，如RSV, TT病毒，HPV, EBV,沙門達(dá)病毒。通過拼接與組裝獲得了4例7型ADV型病毒全基因組序列

12、，相互之間相似度＞99.7％，且與近年來我國(guó)各地報(bào)道的7型腺病毒序列均高度相似(＞98.1％)。PCR擴(kuò)增結(jié)果為7例ADV、MPV和A型流感病毒各1例，與宏基因組測(cè)序結(jié)果基本一致，但漏檢了混合感染中的HPⅣ。
　　宏基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果除去大量正常菌群外，檢出副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、黏液羅斯菌、大腸桿菌等;檢出2例肺炎支原體(MP)和1例熱帶假絲酵母菌，與培養(yǎng)鑒定結(jié)果基本相同，但宏基因測(cè)序可獲得的細(xì)菌種類更全面，易發(fā)現(xiàn)兩種或兩種

13、以上細(xì)菌混合感染。而在真菌鑒定方面，宏基因測(cè)序漏檢了1例白色假絲酵母菌，培養(yǎng)鑒定方法則誤將熱帶假絲酵母菌鑒定為釀酒酵母。
　　1.3腺病毒通用及分型PCR檢測(cè)方法的建立及各亞型流行特征的研究
　　本節(jié)設(shè)計(jì)的ADV通用PCR引物及探針，型特異性分型引物均能擴(kuò)增特異性產(chǎn)物，不同型之間無交叉反應(yīng)。105份陽(yáng)性核酸標(biāo)本使用熒光定量PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，而普通PCR只能檢測(cè)出87例(82.9％)。使用分型PCR對(duì)80份標(biāo)本進(jìn)行了腺病毒分

14、型，其中ADV-3型檢出率最高共有50例(57.5％)、其次ADV-7型23例(26.4％)、ADV4型5例(5.7％)、ADV14型和21型各1例，分別占1.1％。但重癥肺炎患者中ADV-7型(66.7％)的檢出率高于ADV-3型(33.3％)。
　　2.登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評(píng)估
　　2.1登革病毒PCR檢測(cè)體系的建立及廣州登革疫情的流行病學(xué)研究
　　本實(shí)驗(yàn)最終納入了138名登革熱住院患者，其中124例(89.

15、9％)核酸檢測(cè)陽(yáng)性，DENV-1型107例(77.5％)，DENV-2型17例(12.3％)。流行病毒株的E、NS1基因進(jìn)化分析結(jié)果表明DENV-1和DENV-2毒株都與廣東省2006至2013年間流行的病毒株高度相似(＞99％)。
　　2.2登革熱分子診斷與免疫學(xué)檢驗(yàn)方法的比較
　　以首次發(fā)熱時(shí)間為病程第一天，vRNA核酸檢測(cè)陽(yáng)性率在前五天均為100％，七天內(nèi)可維持在80％以上。NS1抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率在第三至第九天持續(xù)維持

16、在90％以上。IgM抗體在第六日開始升高至80％; IgG抗體前8天陽(yáng)性率在20％以下，后續(xù)可穩(wěn)定保持在80％以上。vRNA與NS1抗原檢測(cè)在八天內(nèi)的聯(lián)合診斷率達(dá)到100％; NS1抗原和抗體檢測(cè)在第七至十天的聯(lián)合診斷率為100％。
　　2.3廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗(yàn)結(jié)果的分析
　　所有登革熱患者均會(huì)出現(xiàn)高熱，其中約52.2％的患者出現(xiàn)肌肉、骨關(guān)節(jié)疼痛，31.2％出現(xiàn)明顯皮疹，(20～30)％的患者伴有不同程度的消化

17、道癥狀，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等;病情嚴(yán)重者常出現(xiàn)意識(shí)障礙，多器官功能障礙，甚至休克、死亡。白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)都有明顯降低趨勢(shì)，白細(xì)胞均值在第五天降至最低值(2.85±1.6)/L，血小板均值在第七天左右到達(dá)最低(78±51.8)/L，ALT、AST、CK、LDH、D-Dimer在感染期間有升高趨勢(shì)，大部分患者的血Bun、Cr水平在感染期間無明顯變化。1、2型登革病毒感染患者的各項(xiàng)臨床癥狀的發(fā)生率與檢驗(yàn)結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而8例(5.

18、8％)重癥登革熱患者中有6人(75％)出現(xiàn)意識(shí)障礙，2人(25％)出現(xiàn)休克，2人(25％)死亡。重癥登革熱組的平均住院時(shí)間(18.6±9.5天)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果包括:PLT(29.6±27.2)/L、ALT(138.3±164.6) U/L、 AST(179.5±117.5)U/L、 CK(1969.6±3821.5)U/L、LDH(2743.3±6148.4)U/L、D-Dimer(5113.7±3962.9)ng/ml、Cr(276

19、.4±426.6)umol/L、BUN(10.0±7.5)mmol/L與普通登革熱患者組的結(jié)果相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.呼吸道病毒分子檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用研究
　　本課題建立了中低通量的呼吸道病毒多重PCR篩查體系，能經(jīng)濟(jì)、快速的擴(kuò)增15種常見的呼吸道病毒，不僅可以滿足臨床常規(guī)檢測(cè)的需要，更是應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病快速篩查病原體的重要工具，當(dāng)常規(guī)檢測(cè)無法找到明確的病原體時(shí)，建立的宏基因組測(cè)序方法將以其不依

20、賴特異性擴(kuò)增的技術(shù)特點(diǎn)，及時(shí)檢測(cè)出新發(fā)、再現(xiàn)的或者發(fā)生明顯變異的病毒，同時(shí)還能獲得標(biāo)本中所有微生物種類及相對(duì)含量、從原位標(biāo)本中獲得病毒全基因組序列及毒株突變位點(diǎn)的信息，在臨床病毒的診斷、研究，急性突發(fā)性傳染病的檢測(cè)和監(jiān)控等方面都用重要的應(yīng)用前景。
　　本課題應(yīng)用該檢測(cè)體系發(fā)現(xiàn)感染呼吸道病毒會(huì)增加兒童患鼻竇炎的幾率，其中RV和ADV與兒童急性鼻竇炎的發(fā)病關(guān)系最緊密。兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究結(jié)果顯示，ADV-7型是主要的病原體，并且易

21、引起細(xì)菌、真菌或MP的混合感染，ADV-7基因序列保守，本次獲得的四株7型腺病毒高度相似，結(jié)合我國(guó)多地的病例報(bào)道，提示ADV-7引起的重癥感染在我國(guó)多地散發(fā)。但是，通過自主建立的腺病毒通用及分型PCR核酸檢測(cè)體系對(duì)各亞型腺病毒的流行特點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)腺病毒的流行主要以3型為主，但在重癥肺炎病例中ADV-7型的陽(yáng)性率明顯高于3型。7型腺病毒在下呼吸道的致病性可能高于上呼吸道，是引起兒童重癥肺炎極為重要和關(guān)心的病原體，但其關(guān)鍵性的致病

22、因素尚未研究清楚。
　　2.登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評(píng)估
　　本課題初步建立了登革病毒PCR及熒光定量PCR通用檢測(cè)及分型體系，通過核酸分型檢測(cè)以及對(duì)E、NS1基因序列的進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)此次疫情共有兩型登革病毒(DENV-1，DENV-2)流行，兩種血清型的毒株都與廣東省近年來的多株病毒十分接近。經(jīng)過多年散發(fā)流行和輸入病例的積累，廣東可能已經(jīng)形成了DENV-1，DENV-2的地方性傳播。2014年廣州登革疫情中由1、2型DE

23、NV感染的病例在臨床表現(xiàn)上無差異，而重癥登革熱患者相較普通患者血小板降低更加顯著，出現(xiàn)明顯的心、肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，需要更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行住院治療，各種檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)登革熱患者病情程度的判斷有重要作用，可幫助患者及時(shí)獲得對(duì)癥治療，降低病死率。
　　核酸檢測(cè)是登革熱早期診斷最佳的方法。NS1在早期的靈敏度略低于核酸檢測(cè)，但持續(xù)的時(shí)間較長(zhǎng)。而抗體檢測(cè)則在病程后期有重要的診斷作用。以患者首次發(fā)熱作為病程第一天，八天內(nèi)建議采用核酸檢測(cè)結(jié)合