呼吸道病毒多重逆轉錄聚合酶鏈反應檢測方法的建立及應用.pdf

1、呼吸道病毒是一組能夠通過呼吸道傳播引起呼吸系統(tǒng)或及其他系統(tǒng)疾病的病原微生物。呼吸道病毒傳染性強,可以引起局部暴發(fā)和世界大范圍流行,嚴重影響人類健康。由于呼吸道致病微生物感染臨床癥狀相似,影像學表現(xiàn)缺乏特異性,因此病原學證據(jù)在臨床診斷和流行病監(jiān)控中十分重要,但目前的檢測方法,如病毒分離、病毒抗原檢測和血清學檢測等方法,尚不能滿足高效、快速和高通量的要求。季節(jié)性甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒及豬源H1N1流感病毒是致病性強和傳播速度快

2、的常見重要呼吸道病毒,亟需可以快速、準確鑒別的檢測方法。
　　 目的:
　　 建立一種可同時檢測四種常見呼吸道病毒的多重RT-PCR快速檢測方法。
　　 方法:
　　 1、收集2009年9月至2009年10月在第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院以急性上呼吸道感染為主要表現(xiàn)的門診患者咽拭子標本。
　　 提取病毒RNA,通過常規(guī)RT-PCR方法進行檢測,獲得上感病人常見感染呼吸道病毒病毒學證據(jù);
　　

3、2、使用pBS-TⅡ質粒作為載體,構建包含INFA、INFB、HRV和SOIVs四種病毒目的基因序列的重組子標準品;
　　 3、通過對反應條件和反應體系的優(yōu)化,建立可同時檢測季節(jié)性甲型流感病毒(INFA)、乙型流感病毒(INFB)、人鼻病毒(HRV)和豬源H1N1流感病毒(SOIVs)的多重RT-PCR方法并評價其特異性和敏感性;
　　 4、應用常規(guī)RT-PCR與多重RT-PCR方法同時對上感患者咽拭子進行檢測,比較兩種

4、方法的檢測效能。
　　 結果:
　　 1、在2009年9月至10月,共納入病例36例,其中男21例,女15例,年齡:24+10.08歲。在臨床診斷為急性上呼吸道感染的患者咽拭子樣本中檢測到四種呼吸道病毒(季節(jié)性甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒、豬源H1N1流感病毒),總例數(shù)為12例,其中季節(jié)性甲型流感病毒檢查陽性3例,乙型流感病毒陽性1例,人鼻病毒陽性3例,豬源H1N1流感病毒陽性5例。在流感病毒感染病例中,SOIV

5、s所占比例為55.6％。
　　 2、以pBS-TⅡ質粒作為載體,構建了包含INFA、INFB、HRV和SOIVs四種病毒目的基因序列的重組子,經(jīng)過定量鑒定和稀釋,制各了濃度為101-107 copies/ml的檢測標準品;
　　 3、建立了可同時檢測四種病毒的多重RT-PCR方法,該法可同時或分別擴增INFA212bp、INFB489bp、HRV380bp和SOIVs153bp的基因片段。檢測的敏感性分別為104、104

6、、103、104copies/ml。采用相同的反應體系和反應條件,分別對其他6種常見呼吸道病原體(包括肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌核酸)進行擴增,均未檢測出擴增產(chǎn)物。
　　 4、常規(guī)RT-PCR與多重RT-PCR方法對臨床樣本的檢測陽性一致率為83.3％,經(jīng)X2檢驗兩種檢測方法的檢測效能無統(tǒng)計學差異。同時進行的吻合系數(shù)檢驗提示兩種診斷方法吻合度較強且有統(tǒng)計學意義。
　　 結