實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測乙型肝炎病毒基因型方法的建立和臨床應(yīng)用.pdf

1、我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染高發(fā)區(qū)，乙型病毒性肝炎嚴(yán)重威脅人類的生命健康。HBV基因型的區(qū)分為深入研究乙型肝炎的臨床特點(diǎn)提供了重要手段。HBV的基因型是長期由病毒突變和宿主的篩選累積形成的結(jié)果。目前的研究顯示，不同HBV基因型在病毒變異、疾病表現(xiàn)和治療應(yīng)答等臨床現(xiàn)象方面存在著差異，除了宿主自身的因素之外，病毒基因異質(zhì)性可能起到一定的作用。為進(jìn)一步探討基因型與臨床結(jié)局的關(guān)系，有必要進(jìn)行更大范圍的流行病學(xué)調(diào)查。HBV基因分型檢測可以用于

2、流行病學(xué)調(diào)查，更好得增強(qiáng)臨床用藥和治療方案的針對性，有效遏止HBV流行蔓延。本研究的主旨在于建立一種簡便、靈敏、快速、廉價(jià)的HBV分型方法，即實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)HBV基因分型法并驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。運(yùn)用此方法檢測HBV基因型，與其他HBV基因分型法進(jìn)行比較，并分析HBV的臨床意義。 一、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV基因型B～D方法的建立乙型肝炎病毒具有很高的基因異質(zhì)性，根據(jù)毒株全基因序列的差異可分為A～H8個(gè)基因型[1-

3、4]。HBV基因型的分布具有明顯的地理學(xué)特點(diǎn)[5-7]。在我國，HBV基因型A、B、C和D均有分布，其中B和C為優(yōu)勢基因型，基因型D主要見于少數(shù)民族人群，基因型A較為罕見[8-10]。近來很多的研究表明HBV基因型在HBV感染者的臨床治療和疾病預(yù)后中起著很重要的作用。由于臨床上缺少簡便、準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的HBV基因分型方法，因此難以開展大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，無法詳細(xì)闡明HBV基因型與HBV感染疾病之間的相互影響?；诖四康模Y(jié)合我國的基

4、因型分布特點(diǎn)，我們設(shè)計(jì)了B、C、D型的組合引物探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測HBV基因型的方法，并用此法對132例慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV基因型進(jìn)行了檢測。 本研究根據(jù)HBV型特異性堿基來檢測基因分型。我們在設(shè)計(jì)型特異性引物時(shí)遵循的基本原則是：100bp內(nèi)至少有6個(gè)以上獨(dú)特的堿基才認(rèn)為是型特異性堿基聚集區(qū)。選擇GenBank中已發(fā)表的明確分型的143株HBV，應(yīng)用DNASIS分析軟件對全基因序列進(jìn)行多序列充分比較分析，尋

5、找出B、C、D各型HBVDNA的型特異性堿基聚集區(qū)域，根據(jù)這些片段設(shè)計(jì)各型Taqman探針，再根據(jù)探針設(shè)計(jì)引物。運(yùn)用ABI7000軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。某一型的探針引物只與相同型的模板結(jié)合才發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)，而且本檢測法擴(kuò)增片段短，采用較高的煺火溫度，可以保證擴(kuò)增的特異性。反應(yīng)體系經(jīng)熒光定量PCR儀擴(kuò)增后即可簡便、靈敏、快速地鑒別HBV基因型。結(jié)果顯示：132例標(biāo)本中B型檢出率為19.7％(26/132)，C型占69.7％(92/132

6、)，D型占7.6％(10/132)，4例未分型，占3％(4/132)。 HBV基因型分型標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)是全基因序列同源性≥92％或S基因序列同源性≥96％[11，12]。S基因適于基因分型[13]。我們隨機(jī)選取B、C、D基因型各3株進(jìn)行HBVS區(qū)擴(kuò)增，克隆(每株標(biāo)本各挑取2個(gè)克隆，共18株克隆)測序后應(yīng)用DNASIS分析軟件，將HBVS基因測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的HBV基因型序列進(jìn)行同源性比較，確定其基因型。18株HBV克

7、隆標(biāo)本S基因測序結(jié)果與本分型法完全一致。隨機(jī)選取71例已檢測標(biāo)本和4例未分型標(biāo)本，應(yīng)用特異性引物BS1/S1R[14]擴(kuò)增其S基因，PCR產(chǎn)物純化后直接測序，測序結(jié)果用DNASIS分析軟件與GenBank中已發(fā)表的HBV基因型序列進(jìn)行同源性比較，確定基因型。75例實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測結(jié)果與HBVS基因PCR產(chǎn)物直接測序法檢測結(jié)果比較，1例不符，4例實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測未分型，準(zhǔn)確率達(dá)93.3％(70/75)。 通過實(shí)時(shí)熒光PCR

8、法對132例慢性乙型肝炎患者HBV基因型分析，18株不同基因型HBV克隆測序結(jié)果以及75例HBVS基因PCR產(chǎn)物直接測序法檢測結(jié)果比較，證明實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)HBV基因分型法檢測結(jié)果與后2種基因序列測定法一致。 實(shí)時(shí)熒光PCR基因分型法通過HBV型特異性堿基來區(qū)分基因型，并根據(jù)熒光能量共振原理，把特定熒光的有無及其量的變化與PCR反應(yīng)同步進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)封閉式檢測，大大減少污染的機(jī)會(huì)，而且操作簡便，分型靈敏度高，成本低廉，準(zhǔn)確率

9、高，適用于HBV基因型的大規(guī)模臨床和流行病學(xué)調(diào)查。 二、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV基因型的臨床應(yīng)用由于病毒的基因控制著抗原的表達(dá)；不同的毒株出現(xiàn)某些變異的頻率不同；不同毒株機(jī)體免疫清除抵抗力不同以及其他的因素可能導(dǎo)致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜。 我們運(yùn)用建立的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)HBV基因分型法，檢測蘭州地區(qū)128例慢性乙型肝炎患者基因型，同時(shí)收集HBVDNA、HBV-M等臨床資料，對HBV基因型與疾病臨床情

10、況進(jìn)行了研究分析。研究結(jié)果顯示：1、蘭州地區(qū)CHB患者中基因型主要以C型為主，其次為B型及D型；2、男性與女性的HBV基因型構(gòu)成比無明顯差異；3、基因型C的感染者有更高的HBVDNA含量陽性率，HBeAg陽性率明顯高于基因型B；4、基因型B感染后致抗HBe陽性率高于基因型C。 三、HBV基因型檢測方法的比較隨著HBV基因型概念的提出，基因分型技術(shù)逐漸得到發(fā)展。目前HBV基因分型方法主要有4種：①基因序列測定法[15，16]；②聚

11、合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)[17，18]；③型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法[19，20]；④單克隆抗體酶聯(lián)免疫法[21]。四者比較，基因序列測定結(jié)果準(zhǔn)確，但技術(shù)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)條件要求高，費(fèi)用昂貴，難以常規(guī)使用，不適用于大規(guī)模臨床和流行病學(xué)調(diào)查。其他幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其發(fā)展也經(jīng)歷了由復(fù)雜到簡單，由煩瑣到快速的過程。據(jù)了解，目前國內(nèi)外傳統(tǒng)的臨床診斷方法均無法迅速簡便地檢測HBV基因型，以致于難以全面快速地反映HBV

12、在患者體內(nèi)的感染狀況，在臨床上會(huì)表現(xiàn)為漏診、盲目用藥和延誤治療。同時(shí)，目前一些實(shí)驗(yàn)室采用的基因型檢測方法由于周期長、手段復(fù)雜、費(fèi)用高，無法做到臨床推廣。 本研究用HBVS基因測序方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法對75例慢性乙型肝炎病人血清基因型進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析比較。HBVS基因測序方法檢測出B型14例，C型55例，D型6例；PCR-RFLP方法檢

13、測出B型14例，C型52例，D型8例，未分型1例；實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測出B型12例，C型52例，D型7例，未分型4例。PCR-RFLP和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測結(jié)果比較分析后顯示：兩種方法在檢出率、靈敏度、特異度等方面無明顯差異。HBVS基因序列測定法分型準(zhǔn)確可靠，由于其技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)流程長、實(shí)驗(yàn)條件要求高等原因難以作臨床常規(guī)使用。PCR-RFLP法與實(shí)時(shí)熒光PCR法雖然存在某些不足，但都大大簡化了基因型的檢測步驟，提高了檢測的靈敏度和特

14、異度，縮短檢測時(shí)間，降低檢測成本，可作為臨床上大批標(biāo)本的檢測工作。 詳細(xì)的病毒類型的分子信息是很重要的，是臨床個(gè)體化治療實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，這就要求我們對HBV基因型進(jìn)行深入的了解。HBV基因分型的檢測有利于對HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W和臨床診治進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究。隨著HBV基因型分型方法的日趨完善，將有助于發(fā)現(xiàn)新的HBV基因型及開展流行病學(xué)調(diào)查，了解HBV各基因型毒力的強(qiáng)弱和致病性的關(guān)系，同時(shí)也可用于基因型與療效相關(guān)性的研究。