呼吸道合胞病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)及流行病學(xué)分析.pdf

1、人呼吸道合胞病毒(RSV)是一種非分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15.2Kb左右，依據(jù)基因序列及抗原反應(yīng)性差異將所有RSV分為A和B兩族，每個(gè)族還可以分為多個(gè)基因型。RSV具有很強(qiáng)的感染性，且感染的致死率較高。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了多種RSV檢測(cè)方法，然而這些方法都存在一定的缺陷。關(guān)于上海地區(qū)RSV的流行病學(xué)至今沒(méi)有很好的調(diào)查。
　　為了探索新的RSV檢測(cè)方法，我們利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reversetranscriptionloop

2、-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP)對(duì)RSV進(jìn)行了檢測(cè)。首先，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)49株RSV全基因組序列進(jìn)行了多重比對(duì)分析，并找出基因組中的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)出了針對(duì)A族和B族RSV的共12條引物。然后應(yīng)用正交設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化得到了最適于所設(shè)計(jì)引物的反應(yīng)體系，并用該體系對(duì)引物的靈敏性和特異性進(jìn)行了檢測(cè)。針對(duì)靈敏性，利用該體系和所設(shè)計(jì)的引物測(cè)定了對(duì)A和B族的RSV的檢測(cè)限，發(fā)現(xiàn)對(duì)A族毒株檢測(cè)限為

3、5×101.75TCID50/ml，對(duì)B族毒株的檢測(cè)限為5×10-0.5TCID50/ml，均低于臨床樣本中的RSV滴度。進(jìn)一步，使用本方法對(duì)77個(gè)呼吸道樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率47％，與目前常用的RT-PCR檢測(cè)方法檢出率相當(dāng)。
　　為了對(duì)上海地區(qū)RSV的流行病學(xué)狀況進(jìn)行調(diào)查，我們收集了來(lái)自于南翔醫(yī)院從2009到2012年間的2407個(gè)呼吸道鼻咽拭子樣品，通過(guò)多重PCR檢測(cè)到184個(gè)RSV陽(yáng)性樣本，根據(jù)RSV樣本的時(shí)間分布發(fā)現(xiàn)上海

4、地區(qū)在2009-2010流行季經(jīng)歷了一次RSV病毒大爆發(fā)。對(duì)184個(gè)樣本進(jìn)一步進(jìn)行了DNA序列測(cè)定，獲得了69條RSV內(nèi)G蛋白C末端區(qū)域序列（該區(qū)域?yàn)镽SV基因分型的通用區(qū)域），結(jié)合以前的報(bào)道，通過(guò)進(jìn)化分析確定上海地區(qū)分布著分屬A和B兩族的10個(gè)RSV基因型。根據(jù)兩族RSV的時(shí)間分布分析發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)的流行毒株經(jīng)歷了從B族（2009-2010流行季）到A族（隨后兩個(gè)流行季）的轉(zhuǎn)變。根據(jù)基因型的時(shí)間分布發(fā)現(xiàn)，在RSV爆發(fā)的季節(jié)，有大量的基