shRNA對胰腺癌K-ras突變基因交叉抑制作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究短發(fā)卡RNA(short hair RNA，shRNA)在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮的RNA干擾(RNA interference，RNAi)的作用，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒載體在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平探討特異性shRNA針對胰腺癌細(xì)胞Pane-1和MiaPaCa-2突變型K-ras基因表達(dá)的干擾作用以及對腫瘤生長的抑制作用，并且通過交叉對照組和實(shí)驗(yàn)組及未治療組進(jìn)行比較研究探討針對某一突變類型的特異性shRNA對其他突變類型是否存在影響。

2、 方法：根據(jù)兩種胰腺癌細(xì)胞Panc-1和MiaPaCa-2的K-ras基因第12位密碼子點(diǎn)突變的不同突變類型設(shè)計(jì)目的基因序列，并將目的基因插入pGenesil-1質(zhì)粒載體中構(gòu)建成含有特異目的基因的重組質(zhì)粒表達(dá)載體，經(jīng)測序證實(shí)，所構(gòu)建的重組治理表達(dá)載體中的插入序列與我們設(shè)計(jì)的目的基因序列相同。建立胰腺癌細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型并分為五組：未治療組(control group)、交叉對照組(cross control group)、空質(zhì)粒

3、組(blank plasmid control group)、治療組(experimentgroup)和隨機(jī)序列的陰性對照組(negative control group)。交叉治療組是把含有針對Pane-1細(xì)胞K-ras基因突變的重組質(zhì)粒注射入MiaPaCa-2移植瘤內(nèi)，把含有針對MiaPaCa-2細(xì)胞K-ras基因突變的重組質(zhì)粒注射入Pane-1移植瘤內(nèi)，了解其是否具有特異性；治療組是針對K-ras基因突變類型注射相應(yīng)的特異重組質(zhì)粒

4、。利用大腸桿菌DH5 α擴(kuò)增重組質(zhì)粒，用質(zhì)粒提純試劑盒對質(zhì)粒進(jìn)行純化處理，然后把提純后的各種質(zhì)粒分別注射入各組裸鼠的移植瘤內(nèi)，每兩天注射一次并定期測量移植瘤的長徑和短徑，四周后處死裸鼠取瘤。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)對移植瘤組織分別從RNA水平和蛋白表達(dá)水平檢測重組治理表達(dá)載體對胰腺癌細(xì)胞

5、突變型K-ras基因表達(dá)的干擾作用。根據(jù)移植瘤的長徑和短徑計(jì)算體積并繪制各組的腫瘤生長曲線，觀察重組治理表達(dá)載體對腫瘤生長情況的影響。 結(jié)果：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)結(jié)果經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析處理顯示，胰腺癌細(xì)胞Pane-1的各組移植瘤中，只有轉(zhuǎn)導(dǎo)了針對其突變類型的特異重組質(zhì)粒的治療組的mRNA表達(dá)明顯低于其他各組(P＜0.05

6、)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而交叉對照組與未治療組、空質(zhì)粒組和隨機(jī)序列陰性對照組的mRNA表達(dá)無明顯差別(P＞0.05)，其差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2的各組移植瘤中，只有治療組的mRNA表達(dá)明顯低于其他各組(P＜0.05)，而未治療組、交叉對照組、空質(zhì)粒組和隨機(jī)序列陰性對照組各組之間的mRNA表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析處理顯示，針對Panc-1移植瘤組織，治療組的蛋白表達(dá)明

7、顯低于其它各組(P＜0.05)，而未治療組、交叉對照組、空質(zhì)粒組和隨機(jī)序列陰性對照組各組之間的蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)：針對MiaPaCa-2移植瘤組織的蛋白表達(dá)也符合上述結(jié)果。腫瘤生長曲線經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析處理顯示，治療組腫瘤的體積明顯小于各對照組(P＜0.05)，生長速度也明顯低于各對照組(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而各對照組之間的腫瘤體積和生長速度無明顯差異(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：特異