短發(fā)卡狀RNA抑制AKT2基因治療肝癌的實驗研究.pdf

1、蘇州大學博士學位論文短發(fā)卡狀RNA抑制AKT2基因治療肝癌的實驗研究姓名：謝毅申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（普通外科）指導教師：錢海鑫20100301中文摘要短發(fā)卡狀RNA抑制AKT2基因治療肝癌的實驗研究因表達與腫瘤分期、轉移等臨床指標之間的關系。1通過RTPCR方法檢測32對人肝細胞癌、4例正常肝臟組織AKT2mRNA表達水平：發(fā)現肝癌組織AKT2mRNA的表達明顯高于癌旁組織，其中有28對上調，所占比率高達625％(P005)。

2、3利用Westernblot技術檢測AKT2基因在4株肝癌細胞株中的表達，發(fā)現肝癌細胞株SMMC772lAKT2的表達最明顯。由此可見，AKT2在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮重要作用，抑制AKT2基因的表達將起到控制腫瘤生長的目的。第二部分封閉人肝癌AKT2的siRNA片段設計、篩選、真核表達載體的構建及SMMC7721細胞轉染條件的優(yōu)化’l在哺乳動物細胞的siRNA研究中，有兩個關鍵的步驟，即如何篩選出最有效的針對目標基因的siRNA

3、片段，并使其高效轉染入哺乳動物細胞內和表達。本實驗通過網上的siRNA設計軟件，設計針對AKT2的特異性siRNA。2質粒的擴增、提取及鑒定：采用DH5Cl大腸桿菌為工作菌，制備感受態(tài)細胞，擴增質粒，提取質粒DNA，并經酶切鑒定以備轉染使用。3轉染效率與脂質體的量和質粒量存在交互作用。在6孔板中以Lipofectamine200010lJl，質粒量40ug時轉染效率最高，達到85％以上。Lipofectamine2000轉染中可以看到隨