微小RNA miR-21轉(zhuǎn)基因治療促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷愈合既是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最古老的,同時(shí)也是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可回避的重要之一。從分子水平研究皮膚創(chuàng)傷發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程,已使皮膚創(chuàng)傷研究提高到一個(gè)前所未有的水平。一系列生長(zhǎng)因子、相關(guān)信號(hào)通路和功能蛋白的研究既從分子水平上深化了我們對(duì)于創(chuàng)傷機(jī)理的認(rèn)識(shí),又為促進(jìn)創(chuàng)傷愈合提供了許多新的治療手段和藥物。近年來(lái),一類(lèi)參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子——微小 RNA(microRNAs,miRNAs)在多種生物學(xué)事件中的作用逐漸被揭示,其在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作

2、用也越來(lái)越受到重視。我們和其他學(xué)者的研究表明,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的癌基因 miR-21在小鼠皮膚創(chuàng)傷后表達(dá)上調(diào)顯著,在創(chuàng)面局部抑制這種上調(diào)可以削弱修復(fù)、延緩愈合,提示miR-21是皮膚促愈的潛在靶點(diǎn)。然而,又有學(xué)者報(bào)道,miR-21在靜脈曲張性難愈性潰瘍也呈現(xiàn)高表達(dá),以其模擬物干預(yù)大鼠急性創(chuàng)面認(rèn)為其抑制愈合。創(chuàng)面過(guò)表達(dá)miR-21到底會(huì)對(duì)愈合產(chǎn)生何種影響? miR-21是否為皮膚促愈的潛在靶點(diǎn)?為了明確這些問(wèn)題,本課題分為以下三個(gè)

3、部分進(jìn)行研究:
　　1.pRc/CMV-miR-21真核表達(dá)載體構(gòu)建及其生物活性鑒定。PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度約為390 bp含有pre-miR-21的小鼠基因組DNA序列,產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后純化回收,連接到pRc/CMV空質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌后涂板,挑取克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定和測(cè)序分析獲得pRc/CMV- miR-21陽(yáng)性克隆。同時(shí)構(gòu)建miR-21的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,將含有與miR-21分子完全互補(bǔ)的寡核苷酸序列插入到

4、pMIR-Reporter質(zhì)粒中熒光素酶基因的3′UTR,經(jīng)酶切、測(cè)序證實(shí)獲得pmiR-21-Luc reporter熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。pRc/CMV-miR-21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性克隆,經(jīng) Northern blot檢測(cè)具有成熟 miR-21的陽(yáng)性信號(hào)。共轉(zhuǎn)染 pmiR-21-Luc reporte與pRc/CMV-miR-21,可以有效降低pmiR-21-Luc reporte報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性

5、,表明pRc/CMV-miR-21的產(chǎn)物具有生物活性。
　　2.皮膚創(chuàng)緣注射 pEGFP-N1報(bào)告基因裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因干預(yù)創(chuàng)傷愈合小鼠模型的建立。以pEGFP-N1為報(bào)告基因質(zhì)粒,在小鼠皮膚創(chuàng)緣周?chē)秩c(diǎn)皮下注射pEGFP-N1裸質(zhì)粒,然后觀察EGPF蛋白在小鼠創(chuàng)面愈合中的表達(dá)定位及其強(qiáng)度變化的規(guī)律,以此間接確定mir-21真核質(zhì)粒在干預(yù)后的皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的表達(dá)特點(diǎn)。不同時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面組織的GFP免疫組化結(jié)果表明:GFP陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于

6、新生肉芽組織,其陽(yáng)性比例在傷后早期很低,隨修復(fù)進(jìn)行到第7 d和10 d最高,到修復(fù)末期(15 d)又明顯降低。表明裸質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物高峰期與創(chuàng)面修復(fù)關(guān)鍵期吻合,而愈合后表達(dá)明顯降低,具有自限性,能夠有效干預(yù)創(chuàng)面修復(fù)。進(jìn)一步以pRc/CMV-miR-21裸質(zhì)粒注射到小鼠創(chuàng)面,通過(guò)原位雜交的方法半定量的分析 miR-21的表達(dá)強(qiáng)度,證實(shí)了本方法可以有效提高修復(fù)期新生肉芽中 miR-21的表達(dá)。為后續(xù)功能研究建立了一種簡(jiǎn)單、易行、有效的小鼠創(chuàng)面修

7、復(fù)的轉(zhuǎn)基因治療模型。
　　3.miR-21轉(zhuǎn)基因治療促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的實(shí)驗(yàn)研究。以正常小鼠和自制Ⅱ型糖尿病小鼠的皮膚創(chuàng)面為模型,創(chuàng)緣周?chē)秩c(diǎn)注射pRcCMV-miR-21真核載體表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)和 pRc/CMV空白質(zhì)粒(對(duì)照組)。注射后不同時(shí)相點(diǎn)大體觀察皮膚創(chuàng)面愈合情況,同時(shí)測(cè)定殘留面積和創(chuàng)面愈合時(shí)間。各個(gè)時(shí)相點(diǎn)取材進(jìn)行病理學(xué)觀察,H&E染色觀察創(chuàng)面病理變化,Ki67免疫組化觀察肉芽組織間細(xì)胞的增殖活性, Masson染

8、色觀察致傷30 d后皮膚瘢痕的修復(fù)情況。結(jié)果表示,在正常創(chuàng)面和難愈性創(chuàng)面的大體觀察中,實(shí)驗(yàn)組均比對(duì)照組愈合速度快,約提前2.5 d。致傷后7 d的H&E病理切片也顯示,治療組較對(duì)照組肉芽組織向中心區(qū)域遷移更快,新生肉芽面積更大,但Ki67免疫組化顯示兩組肉芽間質(zhì)中陽(yáng)性細(xì)胞比例相當(dāng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),傷后7 d治療組較對(duì)照組再上皮化明顯較快。在致傷30 d后的Masson染色結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)兩組的膠原沉積均沒(méi)有異常增多,表明miR-21轉(zhuǎn)基因治療