局部Ad-miR-126基因治療促進(jìn)小鼠缺血后肢血管新生作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　組織移植是整形外科臨床上最常用的治療手段,臨床實(shí)踐中往往較厚的組織,以及體積較大的組織,因?yàn)椴荒茉谀腿毖獣r(shí)間內(nèi),及時(shí)、有效的重建血液循環(huán)而不易成活,這仍是整形外科目前在臨床廣泛應(yīng)用中面臨的巨大難題。因此移植術(shù)后能否及時(shí)、有效的重建血運(yùn)是提高移植組織成活率和成活質(zhì)量的關(guān)鍵。而實(shí)現(xiàn)這一目的的重要途徑就是及時(shí)、高效的促進(jìn)缺血局部血管新生。血管新生目前認(rèn)為血管新生主要通過血管形成(angiogenesis)、血管生成(va

2、sculogenesis)以及動(dòng)脈形成(arteriogenesis)三種機(jī)制作用的結(jié)果。在缺血病變中,如何能有效的促進(jìn)血管新生?既往的無論是從各種生長(zhǎng)因子,還是從血管前體細(xì)胞及干細(xì)胞在血管新生中的研究,都只是局限于超過機(jī)體生理量的增加這些對(duì)于血管新生有關(guān)的因子水平,研究中出現(xiàn)各種副作用,比如水腫、腫瘤等,雖取得一些成就,但所存在的各種問題,仍是其在臨床廣泛應(yīng)用的瓶頸。這也使一些學(xué)者改變思路,是否可以從血管新生相關(guān)的信號(hào)通路入手?

3、>　　近年來隨著研究的不斷深入與拓寬,microRNA(miRNA)逐漸引起人們的注意。miRNA具有組織特異性及細(xì)胞特異性,其中內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)miRNA-126(miR-126)在血管新生中具有舉足輕重的作用,通過下調(diào)抑制血管生成信號(hào)通路的胞內(nèi)抑制蛋白(spred-1和PIK3R2/p85β)的表達(dá),從而促進(jìn)血管新生,這給調(diào)節(jié)血管新生提供了一種新的思路,從基因水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)控有可能是解決這個(gè)問題的新突破。
　　對(duì)于miR-

4、126在血管新生方面的研究,目前仍處于初期探索階段,尤其是對(duì)于在活體缺血組織中miR-126水平的表達(dá)情況,是否可以通過人為地改變miR-126水平,來促進(jìn)活體缺血組織的血管新生,以及促進(jìn)缺血組織血管新生作用可能的信號(hào)通路?目前還尚無報(bào)道。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　本課題旨在通過體外擴(kuò)增、合成、克隆mus-mir-126,重組腺病毒包裝、純化以及滴度測(cè)定。局部注射于小鼠的缺血后肢模型,觀察其局部表達(dá)情況的變化,以及促血管新生的作

5、用。通過檢測(cè)miR-126作用通路中各種因子的表達(dá)水平,來探究、證實(shí)miR-126具有明顯的促缺血組織血管新生作用,并初探其作用機(jī)制。使miR-126基因治療在臨床上應(yīng)用成為可能。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　根據(jù)mus-mir-126的基因信息,設(shè)計(jì)上下游引物,用小鼠基因組DNA為模板擴(kuò)增mus-mir-126基因;全基因合成mus-mir-126基因至PES載體上;小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5CMV-IRES

6、-GFP載體上;質(zhì)粒擴(kuò)增及線性化;重組腺病毒的包裝;重組腺病毒的大量擴(kuò)增和滴度測(cè)定。C57小鼠隨機(jī)分為A組(C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組)、B組(空病毒C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組)、C組(重組腺病毒miR-126C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組)、假手術(shù)組(正常小鼠組)四組。借助顯微外科器械建立C57小鼠左后肢缺血模型,術(shù)后即刻將滴度為1×109(PFU/mL)重組腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓腸肌。術(shù)后對(duì)小鼠大體狀

7、況緊密觀察,并在3、7、14天各組(6只)分別對(duì)小鼠腓腸肌取樣,做HE染色,免疫組化CD31、a-SMA染色,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-126水平以及Western-blot對(duì)ERK1/2、pERK1/2、AKT和pAKT蛋白水平的檢測(cè)。整理、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　通過體外構(gòu)建Ad-mir-126測(cè)序結(jié)果正確(見附錄),質(zhì)粒鑒定結(jié)果(見正文)正確,病毒的PFU滴度達(dá)2.00×109(PFU/mL)。通過局部注射于小

8、鼠的缺血腓腸肌中后,觀察到HE染色、CD31、α-SMA免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果一致,均顯示C組較A、B兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯,新生血管數(shù)目計(jì)數(shù)明顯增多。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示A組第3天miR-126表達(dá)水平明顯降低,此后呈逐漸增高的趨勢(shì),直至第14天還未及正常水平。而C組第3天miR-126表達(dá)水平高于正常水平,至第7天達(dá)最高水平,然后逐漸降低,至第14天時(shí)仍高于正常水平。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示C組較A、B組VEGF、bF

9、GF等介導(dǎo)的IP3和MAPK信號(hào)通路中pERK1和pAKT活化水平增高。
　　結(jié)論：
　　體外構(gòu)建重組腺病毒mir-126,測(cè)序結(jié)果正確,質(zhì)粒鑒定結(jié)果完全正確,滴度可達(dá)2.00×109(PFU/mL),說明此技術(shù)既安全又高效,是完全可行的。C57小鼠缺血后肢中內(nèi)源性miR-126的表達(dá)水平明顯降低,通過Ad‐mir-126局部注射于C57小鼠缺血后肢,可以明顯的提高缺血局部miR-126的表達(dá)水平,觀察到促進(jìn)缺血局部血管新生