BM-EPCs促進(jìn)兔急性缺血后肢血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、自從1997年Asahara報(bào)道了內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）參與生后的血管發(fā)生、血管形成、構(gòu)成血管內(nèi)皮和形成新的血管以來，其對(duì)缺血心肌血管生成效應(yīng)已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。EPCs對(duì)缺血下肢的血管生成效應(yīng)與之相似，但研究較少。近年來這種理論也受到了挑戰(zhàn)，有人認(rèn)為EPCs，尤其是由骨髓培養(yǎng)得到的EPCs（BM-EPCs）本身并不參與血管內(nèi)皮的形成，而是通過自身的自分泌或旁分泌VEGF，HGF，G-CSF等細(xì)胞因子，趨化內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形成新的血

2、管。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用自體移植來控制免疫反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，通過EPCs相對(duì)無限自我更新和克隆的特性擴(kuò)增其數(shù)量，以期明確是否骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)而來的EPCs直接參與血管生成，并明顯促進(jìn)兔缺血后肢新血管生成。為EPCs治療下肢缺血更好地應(yīng)用于臨床積累依據(jù)。 目的： 由兔骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)BM-EPCs，將其移植到切除股動(dòng)脈的缺血后肢，通過對(duì)照觀察明確1.是否BM-EPCs自身直接參與新生血管內(nèi)皮的生成；2.BM-EPCs移植是否

3、能在兩周之內(nèi)明顯促進(jìn)兔缺血后肢的血管生成。 方法和材料： 將24只新西蘭白兔隨機(jī)數(shù)字法分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在3%戊巴比妥鈉全麻下（30-45mg/kg），結(jié)扎并切斷左側(cè)股總動(dòng)脈近端及遠(yuǎn)端將分出胭動(dòng)脈和隱動(dòng)脈處，結(jié)扎并切斷其間的包括股深動(dòng)脈的所有可見分支。將此段血管游離丟棄，建成缺血模型。從右后肢脛骨上端以下1cm處穿刺髓腔抽取4ml骨髓，密度梯度離心法分離出單核細(xì)胞，EBM-2培養(yǎng)基添加VEGF、bFGF、IGF等因子誘

4、導(dǎo)，貼壁篩選法選擇培養(yǎng)BM-EPCs，與熒光偶聯(lián)的AC-LDL、UEA-1結(jié)合，熒光顯微鏡鑒定。培養(yǎng)第10天，缺血模型建立后第7天計(jì)數(shù)并肌內(nèi)移植到對(duì)應(yīng)兔的缺血后肢，移植前一天將細(xì)胞與10umol/lBrdu共孵24h，將BM-EPCs標(biāo)記，對(duì)照組注射相同體積的培養(yǎng)基。移植后7天分別隨機(jī)從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組用過量麻醉犧牲6只兔，取其內(nèi)收肌標(biāo)本，固定，分別用CD31、Brdu抗體標(biāo)記毛細(xì)血管和BM-EPCs，計(jì)數(shù)毛細(xì)血管的數(shù)量，觀察EPCs的位

5、置；在14天同法犧牲余下的處理組6只兔和對(duì)照組的6只兔，同法免疫染色，計(jì)數(shù)毛細(xì)血管的數(shù)量，觀察EPCs的位置。 結(jié)果： 1.通過直視下手術(shù)的方法，找到了約Ф1.2mm，Ф0.7mm的髂外動(dòng)脈和股深動(dòng)脈及可見的腹壁淺動(dòng)脈、腹壁下動(dòng)脈、側(cè)旋支、胭動(dòng)脈和隱動(dòng)脈（見圖1），進(jìn)行了髂外分出處以遠(yuǎn)0.5cm到股動(dòng)脈分出胭動(dòng)脈和隱動(dòng)脈處近端0.5cm處約2.5cm長的整段切除，完成了模型制作。術(shù)后所有動(dòng)物立即出現(xiàn)了左后肢跛行，術(shù)后一周

6、與健側(cè)后肢相比均出現(xiàn)肌萎縮，1只出現(xiàn)皮膚干性潰瘍。 圖1家兔股部主要血管示意圖引自第一部分參考文獻(xiàn)[1] 2.選用密度為1.0965±0.001g／cm3的兔淋巴細(xì)胞分離液，對(duì)動(dòng)物骨髓進(jìn)行了密度梯度離心，離心后看到了白膜狀分層標(biāo)志，從兔股骨骨髓中分離到了單核細(xì)胞，用含有VEGF、bFGF、IGF和5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基，結(jié)合貼壁篩選法，誘導(dǎo)出了針形的、可成集落的、呈線狀網(wǎng)狀生長的ac-LDL和UEA-1雙結(jié)合試驗(yàn)陽

7、性的BM-EPCs。 3.在實(shí)驗(yàn)組家兔后肢內(nèi)收肌橫切標(biāo)本中的毛細(xì)血管內(nèi)皮中觀察到了Brdu標(biāo)記的EPCs。細(xì)胞移植后7天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本每高倍視野的毛細(xì)血管數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)/肌纖維比率分別為（x±sd n=6，下同）4.19±1.10和2.47±1.08，P=0.021；0.86±0.38和0.38±0.08，P=0.027。細(xì)胞移植后的14天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本的以上兩個(gè)指標(biāo)分別為5.39±1.58和2.10±1.05，P=0