新鮮分離的脂肪血管基質(zhì)片段細胞促進兔脂肪移植存活的實驗研究.pdf

1、臨床上因先天性畸形、外傷及腫瘤切除術(shù)等各種原因所造成的軟組織缺損的修復(fù)是整形修復(fù)外科面臨的重大難題之一。自體游離脂肪移植，自Neuber于1893年首先報道用以填充切除瘢痕后的缺損以來，已有100多年的歷史。相對于其他軟組織充填法而言，脂肪移植具有許多潛在的優(yōu)點：來源豐富，易于獲取，無免疫原性，并且有良好的物理特性。 然而，脂肪移植物的低存活率及其體積存留的不可預(yù)知性，限制了其臨床應(yīng)用。移植物的存活期差異極大，且大塊移植物的體積

2、隨著時間延長會顯著減小。組織學(xué)檢測顯示移植的脂肪細胞進行性減少，移植物逐漸被纖維組織替代，且通常伴有囊泡形成。研究表明，初期移植物只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養(yǎng)供應(yīng)，而宿主的新生血管長入移植物一般要在移植后5天并且只能侵入移植物的周邊部位，移植物中央部分的組織因缺血而壞死。因此臨床常縮小脂肪移植物的體積，以利于周圍營養(yǎng)物質(zhì)的彌散及利用，直至新生血管形成。 顯然，移植物早期建立及時而充分的血供，是提高其存活率的關(guān)鍵。近年來

3、人們發(fā)現(xiàn)干細胞可促進新生血管形成以及抑制炎癥反應(yīng)，展示了干細胞在脂肪移植應(yīng)用中的美好前景。但應(yīng)用胚胎干細胞，會帶來倫理學(xué)的困擾，且細胞的生物學(xué)特性，如致腫瘤性及自發(fā)畸胎瘤形成等限制了其在非致命性疾病的治療。骨髓間充質(zhì)干細胞作為可再生的成體干細胞，具有成骨、成軟骨等多向分化能力，然而可收集的細胞數(shù)量少，需體外擴增，取材伴隨的并發(fā)癥等也不利于臨床推廣。 脂肪來源干細胞（ASCs）可自切取的以及抽吸的脂肪中均能分離獲取。研究表明，形態(tài)

4、類似成纖維細胞的ASCs，與骨髓干細胞一樣，在體外具有向脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、心肌、平滑肌及骨骼肌等多個譜系分化的能力。值得一提的是ASCs可分化為血管內(nèi)皮細胞，且在缺氧環(huán)境下可分泌促進血管形成的細胞因子，從而促進脂肪移植后的血管化進程。 本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人ASCs混合脂肪顆粒移植于裸鼠皮下，促進新生血管形成，顯著提高脂肪移植物的存活率。然而，體外培養(yǎng)獲取自體ASCs顯然無法完全滿足臨床需要。體外擴增最少需要2

5、-3周的時間，這就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手術(shù)。不僅如此，體外培養(yǎng)操作繁瑣，易污染，安全性低。 因此，如何安全、方便的獲取足夠數(shù)量的、具有生物學(xué)效應(yīng)的ASCs，是其應(yīng)用于脂肪移植臨床的關(guān)鍵。若能建立“脂肪干細胞庫”，可隨時獲取同種異體來源的ASCs，移植則可一期完成，操作相對方便而快捷。近來一系列研究表明，ASCs在體內(nèi)及體外均具有低免疫原性及免疫抑制效應(yīng)，也提供了其同種異體移植應(yīng)用的理論依據(jù)。 然而，應(yīng)用同種異

6、體來源的細胞，也存在交叉感染、安全性低的問題，因此，臨床醫(yī)師更傾向于應(yīng)用自體細胞。我們選擇從脂肪組織中新鮮分離的自體血管基質(zhì)片段細胞（SVFs）輔助脂肪移植，既可避免交叉感染，安全性高，又能一期即時完成手術(shù)，易于臨床推廣?？紤]到脂肪組織分布廣泛，抽脂術(shù)可獲取大量的脂肪，理論上，從這大量脂肪組織中新鮮分離，無需培養(yǎng)即可獲取足夠數(shù)量的、具有生物學(xué)活性的自體ASCs。 本實驗分別以新鮮分離的自體SVF細胞以及體外培養(yǎng)的同種異體ASCs

7、輔助脂肪移植，以培養(yǎng)的自體ASCs以及完全培養(yǎng)基作為對照，通過比較各組移植物濕重測量及HE染色切片分析，評價自體SVFs與同種異體ASCs對脂肪移植物存活率的影響，為臨床選擇一種更加安全、方便而有效的ASCs輔助干細胞療法提供參考。 [材料與方法] 1、成年兔ASCs的體外分離和培養(yǎng) 切取成年兔腹股溝皮下脂肪墊，使用酶消化法獲得SVF細胞，進行原代細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化。細胞傳至第4代后，分成

8、兩等份，分別用于自體及同種異體移植。 2、ASCs的Di-I體外標記 為示蹤脂肪干細胞，將新鮮分離的SVF細胞及培養(yǎng)的第4代ASCs在體外以Di-I標記，熒光顯微鏡觀察細胞顯色情況及形態(tài)變化。 3、兔細胞輔助脂肪移植（CAL）模型的建立 將Di-I標記后的，體外培養(yǎng)第4代自體ASCs（A組）、自體新鮮分離的ASCs（B組）、體外培養(yǎng)第4代的同種異體ASCs（C組）以及完全培養(yǎng)基（D組）與自體脂肪顆粒混合，

9、按隨機化原則注射于家兔腰背筋膜區(qū)皮下的四個受區(qū)（n=14）。 4、ASCs的Di-I體內(nèi)示蹤 1例移植術(shù)后1個月取材，切片檢測Di-I紅色熒光，結(jié)合蘇木素染色切片顯示組織形態(tài)，以揭示ASCs在體內(nèi)的分化轉(zhuǎn)歸。 5、脂肪移植物存活的評價 13例移植術(shù)后6個月取材。測量移植物濕重，切片HE染色，以Gunderson“點計數(shù)”法定量評價移植物纖維壞死及脂肪細胞存活情況，以及新生血管密度。 6、統(tǒng)計學(xué)分析

10、 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示；四組脂肪移植物平均濕重的比較，血管密度、存活脂肪組織點數(shù)及纖維壞死組織點數(shù)的比較均采用隨機區(qū)組設(shè)計資料的方差分析，各組均數(shù)的多重比較采用LSD法，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.術(shù)后6個月，自體ASCs組（A組）移植物濕重為（0.2693±0.0673）g，自體SVFs組（B組）濕重為（0.291±0.0721）g，同種異體ASCs組（C組）濕重為（0.2

11、579±0.0715）g，均顯著高于對照組（D組），（0.1778±0.06）g，P<0.05.A，B，C三組濕重均數(shù)之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可提高脂肪移植物的長期存活率。 2.A組血管截面計數(shù)為（12.7±3.1）個/HPF，B組為（13.2±3.7）個/HPF，C組為（11.2±2.5）個/HPF，均顯著高于對照組D組，（6.9±2.8）個/HPF，

12、P<0.05.A，B，C三組血管截面計數(shù)均數(shù)之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。說明自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可促進脂肪移植物新生血管的形成。 3.A組切片存活的脂肪細胞計數(shù)為（6503±851）個/10HPF，B組為（6820±1021）個/10HPF，C組為（6658±858）個/10HPF，均顯著高于對照組D組，（905±383）/10HPF，P<0.05.A，B，C三組存活脂肪細胞計數(shù)均

13、數(shù)之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。結(jié)果顯示與自體ASCs一樣，經(jīng)自體SVFs及同種異體ASCs干預(yù)后脂肪移植物中脂肪細胞的存活數(shù)量均較培養(yǎng)基對照組明顯增加。 4.A組切片纖維壞死細胞計數(shù)為（6336±848）個/10HPF，B組為（6135±918）個/10HPF，C組為（6181±829）個/10HPF，均顯著低于對照組D組，（11694±625）個/10HPF，P<0.05.A，B，C三組纖維壞死組織計數(shù)點均數(shù)之間

14、兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。結(jié)果顯示與自體ASCs一樣，經(jīng)自體SVFs及同種異體ASCs干預(yù)后均可減少脂肪移植物中纖維組織的形成及脂肪細胞的壞死數(shù)量。 5.熒光顯微鏡下，A，B，C三組均發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞部分激發(fā)紅色熒光。完全培養(yǎng)基對照組未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。結(jié)果提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣在體內(nèi)可向血管內(nèi)皮細胞分化，從而參與脂肪移植物的血管化進程。 [結(jié)論] 1.新鮮分離的自體SVFs