不同層次顆粒脂肪移植存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　應(yīng)用自體脂肪移植已有上百年的歷史，最初為塊狀或帶蒂移植，用于全身各個(gè)部位軟組織凹陷與缺損的填充。隨著脂肪抽吸技術(shù)的問(wèn)世，使得顆粒脂肪注射移植技術(shù)成為可能，由于其來(lái)源豐富、取材容易、操作簡(jiǎn)單、安全無(wú)排異反應(yīng)、外形自然、手感柔軟等優(yōu)點(diǎn)，
　　然而，顆粒脂肪移植后的高吸收活率和各種并發(fā)癥如鈣化、壞死、硬化結(jié)節(jié)和液化囊腫等限制了該顆粒脂肪注射移植技術(shù)在臨床的廣泛開(kāi)展。因此，如何提高顆粒脂肪移植術(shù)后成活率，從而控制遠(yuǎn)

2、期填充效果，成為整形外科臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)理論研究中的重大難題之一。近十余年來(lái)眾多學(xué)者針對(duì)脂肪供區(qū)選擇、脂肪獲取方法、脂肪純化方式、脂肪注射方式等方面，從細(xì)胞因子治療、基因治療及細(xì)胞治療等多角度進(jìn)行了大量研究，以提高移植脂肪的成活，盡管上述種種方法在促進(jìn)移植物血管新生、預(yù)防或減輕纖維化、提高成活率方面取得了一定的效果。
　　以往研究顯示，脂肪組織有著相當(dāng)豐富的血液供應(yīng)，每個(gè)脂肪細(xì)胞都有單獨(dú)的血管供應(yīng)系統(tǒng)與主干相連以保證每個(gè)脂肪細(xì)胞的營(yíng)

3、養(yǎng)供應(yīng)，形成類(lèi)似葡萄串樣的結(jié)構(gòu)。在顆粒脂肪注射移植過(guò)程中脂肪的獲取、收集以及注射等對(duì)脂肪細(xì)胞以及供應(yīng)血管構(gòu)成損傷，僅殘留少部分的血管片段，嚴(yán)重影響到移植物的血液供應(yīng)。此外成熟的脂肪細(xì)胞內(nèi)含有一大脂肪滴，少量細(xì)胞器被擠向邊緣，特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定了脂肪細(xì)胞的高耗能性，成熟的脂肪細(xì)胞很容易因缺血缺氧而發(fā)生壞死，從而影響移植脂肪的成活。顆粒脂肪移植早期移植物尚未與受區(qū)建立良好的血液供應(yīng)時(shí)，缺乏有效的血液供應(yīng)而處于缺血缺氧狀態(tài)，脂肪移植物僅通過(guò)周

4、圍組織的血漿灌注獲取氧及營(yíng)養(yǎng)，直至內(nèi)部血管化的形成及與毛細(xì)血管的連接建立。然而組織間液的滲透能力只有約150-200微米，在此滲透范圍以外的脂肪細(xì)胞應(yīng)該大部分發(fā)生壞死，但是對(duì)脂肪移植的長(zhǎng)期標(biāo)本觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，脂肪移植物最終存活下來(lái)的區(qū)域并不僅限于由外周往內(nèi)部的150-200微米內(nèi)。這一結(jié)果提示在脂肪移植的后期過(guò)程中，存在著脂肪組織的新生與血運(yùn)的重建。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，顆粒脂肪移植后血運(yùn)重建主要是由宿主來(lái)源的新生血管長(zhǎng)入而成，移植物絕大部

5、分區(qū)域的細(xì)胞為宿主來(lái)源，因此宿主也就是受區(qū)的血管化條件、細(xì)胞再生條件在移植物成活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　目前對(duì)不同受區(qū)脂肪移植成活率的研究尚存有爭(zhēng)議，1996年Guerrerosantos首先在大鼠肌肉內(nèi)進(jìn)行脂肪移植獲得成功。Karacaoglu進(jìn)行了兔皮下、肌肉上、肌肉下脂肪移植的比較，發(fā)現(xiàn)6個(gè)月后咬肌上保存率約82％，其認(rèn)為可以通過(guò)選擇受區(qū)來(lái)提高脂肪移植的存活。但Rieck則發(fā)現(xiàn)移植脂肪的成活率為皮下30％，肌肉內(nèi)6％，肌

6、肉內(nèi)注射并不增加成活，原因可能是肌肉間空隙小、張力大，雖然肌肉中血供豐富，但活動(dòng)時(shí)肌肉收縮擠壓移植脂肪，反而影響血供。臨床方面，Yoshimura等認(rèn)為，胸大肌前后間隙血管豐富且利于乳房塑形，故此兩層次均適合注射脂肪，面部脂肪移植最佳的注射層次可能包括皮下脂肪和肌肉層。Coleman等認(rèn)為，不僅在胸大肌前后間隙，在胸大肌內(nèi)亦適合注射脂肪。李青峰認(rèn)為脂肪組織間的脂肪顆粒移植較其他部位有更高的存活率，受區(qū)組織生理同源性環(huán)境有利于移植脂肪的成

7、活。究竟皮下、脂肪內(nèi)和肌肉內(nèi)何為顆粒脂肪移植的最佳受區(qū)，目前尚無(wú)定量的實(shí)驗(yàn)證實(shí);對(duì)于不同移植部位所導(dǎo)致的成活率差異仍缺乏進(jìn)一步的研究。
　　基于以上科學(xué)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)將帶有綠色熒光小鼠的顆粒脂肪分別注射移植到普通C57小鼠的背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi)，觀(guān)察不同組織層次移植脂肪的生存狀況，從而選擇最佳的脂肪移植受區(qū)。明確這個(gè)問(wèn)題對(duì)提高脂肪移植成活率有著重要的意義。
　　方法：
　　采用兩種近交系小鼠，將由GF

8、P小鼠獲取的雙側(cè)腹股溝脂肪剪碎，通過(guò)16-gauge針頭將其分別注射移植到C57小鼠的雙側(cè)背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi)，每個(gè)注射點(diǎn)注射量為0.1ml。實(shí)驗(yàn)分為三組（每組35只）:皮下組(subcutaneous);肌肉內(nèi)組（intramusculary）;脂肪內(nèi)組(fat pad)。
　　1、濕重測(cè)量
　　取0.1ml GFP鼠腹股溝粉碎脂肪稱(chēng)重，做為之后脂肪移植物濕重基線(xiàn)，注射后每組分別于1、4、8、12、16

9、周(W)處死小鼠各7只取材，并再測(cè)濕重(n=7)。得出移植物的濕重保存率。
　　2、組織學(xué)觀(guān)察，毛細(xì)血管密度測(cè)量和結(jié)締組織定量
　　將三組獲取的脂肪組織HE染色，切片顯微鏡觀(guān)察、數(shù)碼相機(jī)拍照。40倍鏡下觀(guān)察每個(gè)HE切片20個(gè)視野中毛細(xì)血管數(shù)，評(píng)估新生血管形成。
　　3、GFP表達(dá)和CD34、Ki67免疫組化染色
　　熒光顯微鏡觀(guān)察冰凍切片綠色熒光表達(dá)。每個(gè)移植物100倍鏡下合成完整圖像，使用ImageJ軟件測(cè)定G

10、FP陽(yáng)性所占總面積的百分比，了解移植物中移植物來(lái)源組織所占比例。選取顆粒脂肪移植后4W的組織，進(jìn)行CD34、Ki67免疫組化染色以比較組織內(nèi)CD34陽(yáng)性前體細(xì)胞數(shù)量，從而探討組織再生能力。
　　結(jié)果：
　　1、大體觀(guān)察:1W時(shí)3組移植物表面均可見(jiàn)包膜形成，大體觀(guān)察無(wú)明顯差異。8W時(shí)脂肪內(nèi)組體積稍大于其他兩組，16W時(shí)脂肪內(nèi)組移植物體積明顯大于其他兩組移植物，且外觀(guān)上更接近正常脂肪。移植物的濕重保存率:三組移植物保存率均在移植

11、后出現(xiàn)了明顯的下降，1-8W下降最為明顯，8-16W保存率趨于平穩(wěn)。脂肪內(nèi)組保存率第8周起即明顯高于皮下組及肌肉內(nèi)組(P＜0.05)，16W皮下組保存率明顯高于肌肉內(nèi)組(P＜0.05)。
　　2、組織學(xué)觀(guān)察:皮下組內(nèi)脂肪壞死區(qū)域較多，肌肉內(nèi)組最小。4W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物表現(xiàn)出更好的血管化和小體積脂肪細(xì)胞，至16W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物組織結(jié)構(gòu)十分接近正常脂肪組織，但肌肉內(nèi)組中成熟脂肪細(xì)胞的直徑明顯小于其他兩組。半定量測(cè)量:

12、三組移植物的血管密度及血管化結(jié)締組織面積變化類(lèi)似，移植后4周達(dá)到高峰，4W后較為緩和下降。肌肉內(nèi)組中的血管密度在移植后4周起即明顯高于其他兩組。結(jié)果提示肌肉內(nèi)移植物血管化最好，而長(zhǎng)期觀(guān)察脂肪墊內(nèi)移植物成脂效果最好。
　　3、三組移植物GFP陽(yáng)性的區(qū)域隨時(shí)間逐漸減少，且集中于移植物外圍，半定量熒光面積在移植后1-8W下降明顯，8-16W緩和下降。肌肉內(nèi)組中的熒光面積比率從第4周開(kāi)始即一直高于其余兩組(P＜0.05)。皮下組及脂肪內(nèi)組

13、在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示三組移植物外圍均可見(jiàn)來(lái)源于移植物的脂肪細(xì)胞存活，肌肉內(nèi)移植物來(lái)源脂肪細(xì)胞存活率最高。4WCD34、Ki67免疫組化染色，脂肪墊移植物內(nèi)有增殖活性的（Ki67表達(dá)陽(yáng)性）CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多。
　　討論：
　　Yoshimura等近期的研究指出，脂肪移植后的保存并非簡(jiǎn)單的存活或替代，而是一種混合的保存方式:存活區(qū)（最外層）、壞死區(qū)（中央層）、再生區(qū)（外層和中央層之間），即移植物外層存活，內(nèi)

14、層被ASCs參與的組織再生所取代，中央壞死區(qū)域被吸收或形成油囊，油囊的存在一定時(shí)間內(nèi)起到支架作用，使移植物保留一定的體積。因此，影響移植物遠(yuǎn)期保存的兩個(gè)根本因素為源自移植物組織的存活以及組織再生狀況。
　　然而有趣的是，濕重測(cè)量顯示脂肪墊內(nèi)最終成活率最高,而在血管環(huán)境最好的肌肉內(nèi)最終成活率最低。其原因何在?我們認(rèn)為可能有兩個(gè)原因，第一，Yoshimura等研究提示正常脂肪細(xì)胞耐受缺血缺氧能力很差，僅有移植物外圍小于300μm的范圍

15、內(nèi)的脂肪細(xì)胞通過(guò)吸收滲透組織液的營(yíng)養(yǎng)來(lái)度過(guò)缺血缺氧期，超過(guò)此有效距離的脂肪細(xì)胞大都?jí)乃?，接著在耐受缺血缺氧能力?qiáng)的脂肪干細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞/祖細(xì)胞啟動(dòng)下新生的脂肪細(xì)胞替換死亡的脂肪細(xì)胞，脂肪移植后期成熟的脂肪細(xì)胞主要來(lái)源于干細(xì)胞啟動(dòng)的再生。遠(yuǎn)期脂肪移植成活率是由之后的脂肪再生決定的，肌肉內(nèi)脂肪移植物中雖然有一定的移植物來(lái)源組織存活，但在移植物長(zhǎng)期體積保存中所占比例較少，對(duì)遠(yuǎn)期體積保存的最終結(jié)果影響較少。第二，組織來(lái)源或宿主來(lái)源干細(xì)胞/祖細(xì)胞

16、（如ASCs）在脂肪移植后脂肪再生中發(fā)揮著重要作用。有研究表明微環(huán)境決定了ASCs的命運(yùn)和活性，脂肪墊內(nèi)含有大量ASCs以及各種細(xì)胞所分泌的了促進(jìn)成脂的因子，能為移植物提供一個(gè)適當(dāng)?shù)某芍h(huán)境，這是脂肪移植后脂肪再生的關(guān)鍵。
　　機(jī)械力引起的肌肉運(yùn)動(dòng)有可能抑制ASCs的成脂分化。有研究指出，游離脂肪加上肉毒素A聯(lián)合注射，可以顯著降低脂肪移植重吸收水平。脂肪組織的各種細(xì)胞，特別是ASCs，是有力學(xué)敏感性的。有研究發(fā)現(xiàn)靜態(tài)拉伸或低應(yīng)力

17、可以促進(jìn)脂肪生成。然而動(dòng)態(tài)機(jī)械力例如:循環(huán)拉伸或振動(dòng)和靜態(tài)壓縮抑制脂肪生成。不僅機(jī)械力可以影響分化，而且基質(zhì)硬度直接針對(duì)性影響間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。這或許可以解釋16W時(shí)為什么肌肉內(nèi)脂肪移植成熟脂肪細(xì)胞直徑與其它兩組相比顯著偏小，肌肉內(nèi)脂肪移植成活率低可能部分與肌肉運(yùn)動(dòng)有關(guān)。同樣的我們發(fā)現(xiàn)脂肪墊內(nèi)與皮下層脂肪移植后移植物毛細(xì)血管密度沒(méi)有明顯差異，但脂肪墊內(nèi)脂肪移植物比皮下層有更好的成活率。不同受區(qū)脂肪移植成活率的差異有可能是不同的生物、化