兔脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿對脂肪移植成活率的影響.pdf

1、背景：自體脂肪移植因具有來源充足、獲取方便、對機(jī)體損傷小、無排異反應(yīng)并可長期存活于填充部位等優(yōu)點(diǎn)，已被整形美容外科廣泛應(yīng)用于軟組織填充與重建，但脂肪移植后不確定的高吸收率及液化、壞死、鈣化等缺陷逐漸顯現(xiàn)出來，限制了進(jìn)一步的發(fā)展應(yīng)用。富血小板血漿（Platelet-rich plasma,PRP）是將自體血通過梯度離心得到的血小板濃縮物,其血小板被激活后可釋放多種生長因子。很多研究已經(jīng)證實(shí)富血小板血漿中的生長因子對軟組織損傷修復(fù)、骨組織生

2、長等有促進(jìn)作用,并可以促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖及移植脂肪周圍血管化的生成，減少移植脂肪組織炎性反應(yīng)，從而提高其存活率。脂肪來源的成體干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)、造血細(xì)胞等，且組織相容性好、低免疫原性，做為良好的種子細(xì)胞大量應(yīng)用于組織工程研究。研究證明脂肪組織中富含的干細(xì)胞群其較強(qiáng)的更新能力使脂肪細(xì)胞得到不斷的更新，因此國內(nèi)

3、外學(xué)者就如何促進(jìn)脂肪組織中干細(xì)胞增殖分化以提高移植脂肪存活率做了大量研究。
　　目的：通過建立動物模型,將提取的兔 ADSCs及富血小板血漿與自體脂肪組織一同植入裸鼠皮下,于不同時間段取出，從移植物的大體外觀、組織學(xué)等方面觀察PRP聯(lián)合ADSCs對脂肪移植物成活的影響，從而為提高脂肪移植成活率的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴從新西蘭大白兔背部取出脂肪組織，用改良I型膠原酶消化法體外提取ADSCs，傳代培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特

4、征。⑵流式細(xì)胞儀測定其表面標(biāo)志物，成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行油紅 O及茜素紅染色，鑒定其符合ADSCs的生物學(xué)特性。⑶Appel法提取兔富血小板血漿并進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。⑷MTT法測定實(shí)驗(yàn)組（ADSCs+PRP）、對照組（ADSCs+PBS）及空白組（完全培養(yǎng)基+PBS）不同時間段對兔脂肪干細(xì)胞增殖的影響。⑸獲取并處理脂肪顆粒。15只裸鼠隨機(jī)編號分組，分為3組，每組5只。于裸鼠背部取4點(diǎn)，體內(nèi)分4組：①脂肪顆粒0.1ml+PBS0.1ml②脂

5、肪顆粒0.1ml+ADSCs0.05ml+PBS0.05ml③脂肪顆粒0.1ml+PRP0.05ml+PBS0.05ml④脂肪顆粒0.1ml+ADSCs0.05ml+PRP0.05ml。將各組移植物植入裸鼠皮下。⑹不同時間點(diǎn)（7d、14d、30d）取出，大體觀察新生組織塊，HE染色及免疫組化處理，觀察組織形態(tài)，計(jì)算空泡及壞死面積及微血管數(shù)。結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：①ADSCs原代培養(yǎng)4h左右開始貼壁，細(xì)胞大小不等，24h部分

6、貼壁，細(xì)胞呈多角形、類圓形，培養(yǎng)基中見未貼壁的紅細(xì)胞及筋膜雜質(zhì)，48h半量換液貼壁細(xì)胞呈三角形、短梭形生長。前3d細(xì)胞處于潛伏期，生長緩慢，之后細(xì)胞增殖迅速，6d左右可達(dá)80％融合，細(xì)胞呈長梭樣，并呈現(xiàn)漩渦狀、集落狀生長。對此進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞4-6h可大部分貼壁。第2代尚見少量細(xì)胞呈多角形，漩渦樣、成纖維樣生長明顯，傳至3代至以后時，細(xì)胞增殖速度明顯加快，細(xì)胞呈成纖維樣、魚群樣穩(wěn)定生長，傳至10代細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)

7、胞表面標(biāo)記物進(jìn)行測定，陽性表達(dá) CD29、CD44，陰性表達(dá) CD45、CD34，成脂、成骨誘導(dǎo)分化后油紅O及茜素紅染色結(jié)果均為陽性，對照組呈陰性。②全血血小板計(jì)數(shù)結(jié)果：PRP血小板計(jì)數(shù)是全血的4.34倍。③細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MTT法顯示PRP組在24h、48h、72h時對ADSCs的增殖較對照組增殖明顯，與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05)。④各時間段內(nèi)脂肪顆粒+ADSCs+PRP組空泡及壞死面積低于其他組（P＜0.05），移植脂肪存活率較高