丹參聯(lián)合hADSCs對脂肪顆粒移植成活率的影響.pdf

1、目的：將丹參與人脂肪來源干細(xì)胞聯(lián)合，通過動物實(shí)驗(yàn)，探討二者綜合作用對自體脂肪顆粒植入裸鼠皮下后成活率的影響，進(jìn)而指導(dǎo)臨床應(yīng)用。
　　方法：體外分離、培養(yǎng)、鑒定hADSCs：脂肪取自接受吸脂手術(shù)的1名25歲健康女性的腹部，兩次吸脂手術(shù)皆是求美者自愿捐贈。取出的脂肪置于無菌離心管中適量的，加入適量磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），運(yùn)用離心法將脂肪顆粒純化，去除位于離心管上層的油脂、及位于離心管下層的雜質(zhì)后，剩余的脂肪顆粒用于hADSCs的制備

2、，第二次抽取的脂肪顆粒同樣的方法處理后將脂肪顆粒置于無菌射器中為脂肪顆粒移植備用。選取24只8周齡健康雌性裸鼠，體重（23±3）g，隨機(jī)分為四組（n=6），A組：脂肪顆粒0.5ml；B組：脂肪顆粒0.5ml+hADSCs；C組：丹參注射液(0.5g·kg-1·d-1)[1]+脂肪顆粒0.5ml；D組：丹參注射液(0.5g·kg-1·d-1)+脂肪顆粒0.5ml+hADSCs。干細(xì)胞與顆粒脂肪比例為：6×105：0.5ml。A、B兩組每天

3、腹腔注射與C、D組的丹參注射液等體積的生理鹽水。將脂肪顆粒按規(guī)定移植入各組裸鼠背部兩側(cè)對稱的皮下。移植術(shù)后15天每組隨機(jī)選取3只裸鼠處死后取材。取材后，首先對標(biāo)本進(jìn)行大體觀察，觀察組織的體積大小、包膜情況，包膜表面的毛細(xì)血管形態(tài)特征。然后將標(biāo)本放入10％甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，將每塊標(biāo)本做5張切片，1張切片用于HE染色，剩余4張切片為免疫組織化學(xué)染色備用，用于觀察并計(jì)數(shù)微血管個數(shù)。脂肪顆粒移植術(shù)后第30天處死各組剩余的裸鼠，將取

4、出的標(biāo)本進(jìn)行體積測量。然后將標(biāo)本用10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，每塊標(biāo)本取一張切片做HE染色。
　　結(jié)果：
　　1.人脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定：細(xì)胞提取物由DMEM培養(yǎng)液重懸后，將細(xì)胞懸液接種于75cm2的無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)7-9天后培養(yǎng)瓶中可觀察到有大量梭形細(xì)胞及少量的多角形細(xì)胞，多角形細(xì)胞幾天后會逐漸變形為梭形細(xì)胞，14天左右可觀察到梭形細(xì)胞呈旋渦狀或束狀生長。由于原代培養(yǎng)脂肪組織中混有少量血管等其他的組織

5、，因此培養(yǎng)瓶中會培養(yǎng)出個別紅細(xì)胞和其他雜質(zhì)細(xì)胞，而隨著脂肪干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，脂肪干細(xì)胞越來越純。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)13-14天時，原代細(xì)胞能達(dá)到80%融合，即可進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞增長速度加快，每4-5天即可傳1代。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測：檢測結(jié)果表明CD29、CD44、CD90的表達(dá)率均在92%以上；CD31、CD45、CD146陽性率均小于6%，是幾乎不表達(dá)的，證明該實(shí)驗(yàn)中所培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)是hADSCs，且hADSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞

6、的一種。
　　3.移植物組織學(xué)肉眼觀察：移植術(shù)后第15天，取出的移植體均可見完整的包膜形成，可見新生毛細(xì)血管走形在包膜表面，幾組結(jié)果對比，新生的毛細(xì)血管最為豐富的是D組移植物，新生毛細(xì)血管最少的是A組， B，C兩組的毛細(xì)血管數(shù)量介于A、D兩組之間；移植術(shù)后第30天，移植物的體積D組最大，A組的體積最小，B、C兩組的體積大小介于A、D兩組體積大小之間。
　　4.免疫組化檢測移植脂肪的微血管數(shù)量：對術(shù)后15天各組脂肪移植體免疫組

7、化切片血管密度值采用 LSD-t法進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A組與 B組，A組與C組，A組與D組，B組與D組，C組與D組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而B組與C組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可以認(rèn)為D組的血管密度值最高，A組的血管密度值最低，B組和C組的血管密度值介于A組與D組之間。
　　5.丹參聯(lián)合hADSCs對移植顆粒脂肪體積的影響：術(shù)后30天各組脂肪移植體體積值采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A組與B組，A