兔脂肪來源干細(xì)胞分離培養(yǎng)及富血小板血漿對(duì)其增殖的影響.pdf

1、背景：自體脂肪移植已有上百年的歷史，因其來源豐富、取材容易、操作簡單、充盈外形好、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，倍受整形美容外科醫(yī)生的重視，但同時(shí)也存在不足之處，其中最主要是移植后脂肪細(xì)胞的成活率較低(＜60％)。如何提高脂肪細(xì)胞的增殖及分化能力，是提高移植成活率的重要環(huán)節(jié)。隨著脂肪組織工程的發(fā)展及研究，尋求來源廣、易獲取、損傷小、穩(wěn)定擴(kuò)增的種子細(xì)胞和無免疫反應(yīng)、高效、廉價(jià)、配比協(xié)同作用好的生長因子是關(guān)鍵問題。
　　 目的：分離培養(yǎng)兔脂肪來

2、源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，并觀察ADSCs體外生長的生物學(xué)特性及增殖分化潛能，探討自體富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)對(duì)ADSCs增殖的影響。
　　 方法：1．實(shí)驗(yàn)采用新西蘭大白兔，取兔頸背部區(qū)脂肪墊，貼壁法及Ⅰ型膠原酶消化法體外培養(yǎng)兔ADSCs，觀察其形態(tài)特征。
　　 2．取第3代ADSCs進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，兩周后油紅0成脂染色及

3、三周后茜素紅成骨染色鑒定。
　　 3．抽取兔心臟血，采用二次離心法制備PRP，并行全血及PRP血小板計(jì)數(shù)。
　　 4．將第3代細(xì)胞分為對(duì)照組(細(xì)胞180ul+單純DMEM培養(yǎng)基20ul)、全血組(細(xì)胞180ul+全血血漿20ul)和PRP組(細(xì)胞180ul+PRP20ul)，采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)檢測不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)各組對(duì)ADSCs增殖活動(dòng)的影響。
　　

4、結(jié)果：1．原代培養(yǎng)的細(xì)胞24h后見少量橢圓形細(xì)胞貼壁，大部分未貼壁細(xì)胞為圓形的紅細(xì)胞及筋膜雜質(zhì)。48h首次換液，除去未貼壁的紅細(xì)胞及筋膜雜質(zhì)，見小部分貼壁細(xì)胞呈短梭形，其間也可見三角形、多角形細(xì)胞。3d后見部分細(xì)胞已貼壁伸展，呈長梭形，可見核分裂相，梭形細(xì)胞逐漸增多。7d后見細(xì)胞80%-90%融合，細(xì)胞呈漩渦樣生長，大小不一，細(xì)胞多為長梭形成纖維細(xì)胞樣。傳代細(xì)胞4-6h即可貼壁，細(xì)胞形態(tài)與原代相似，細(xì)胞生長速度較原代細(xì)胞明顯增快。

5、>　　 2．細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后油紅0染色呈陽性，對(duì)照組為陰性；細(xì)胞成骨誘導(dǎo)三周后茜素紅染色呈陽性，對(duì)照組為陰性。
　　 3．全血血小板計(jì)數(shù)為(313.0±137.5)×109/L，PRP血小板計(jì)數(shù)為(1267.0±760.2)×109/L，PRP血小板計(jì)數(shù)是全血的4.08倍。
　　 4．CCK-8法顯示PRP組在24h、48h、72h時(shí)較對(duì)照組增殖明顯(P＜0.01)。且在第24h、48h、72h時(shí)，與全血組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

6、異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1．通過膠原酶消化法從兔頸背部區(qū)提取的脂肪組織分離得到的細(xì)胞，經(jīng)鑒定證實(shí)為ADSCs。采用這種方法獲得的細(xì)胞增殖迅速，可長期傳代并維持穩(wěn)定的增殖能力。
　　 2．ADSCs具有多向分化潛能，在特定條件下能夠向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，可作為組織工程的種子細(xì)胞。
　　 3．通過二次離心成功提取兔PRP，血小板計(jì)數(shù)后，PRP的血小板計(jì)數(shù)控制在全血的4倍以上，二次離心法是制備PR