富血小板血漿(PRP)對(duì)肌腱干細(xì)胞生物學(xué)影響的研究.pdf

1、肌腱病(Tendinopathy)的發(fā)病率極高，是骨科、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)、職業(yè)病防治和老年醫(yī)學(xué)的常見疾病。肌腱病嚴(yán)重影響人們的工作與生活，特別影響運(yùn)動(dòng)員競技水平的發(fā)揮，常迫使優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員提早退役。肌腱病的主要臨床表現(xiàn)為肌腱或肌腱-骨胳連接處的疼痛、壓痛甚至斷裂、關(guān)節(jié)活動(dòng)度受限。肌腱腱病最常見的發(fā)病部位依次為髕腱、跟腱、岡上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌總腱止點(diǎn)。足底筋膜炎、跟腱炎、髕腱炎、網(wǎng)球肘、高爾夫肘、岡上肌腱炎都是肌腱病。雖

2、然肌腱病如此常見，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，常認(rèn)為與肌腱韌帶的急慢性損傷有關(guān)。
　　 新近發(fā)現(xiàn)的肌腱干/祖細(xì)胞(Tendon stem/progenitor cells，TSPCs)，也稱為肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs)或肌腱源性干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后可直接成為腱細(xì)胞，具有成體干細(xì)胞的自我復(fù)制和誘導(dǎo)成脂、成軟骨、成骨分化的潛能，是腱細(xì)胞的前體細(xì)

3、胞。研究表明，TSCs參與肌腱的急慢性損傷修復(fù)，是肌腱急慢性損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵效用細(xì)胞。不同劑量的反復(fù)循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激可影響肌腱干細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)行為，進(jìn)一步導(dǎo)致肌腱內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和肌腱病的發(fā)生。應(yīng)用體外循環(huán)機(jī)械牽伸系統(tǒng)模擬細(xì)胞在體反復(fù)機(jī)械應(yīng)力狀態(tài)，證明4％的機(jī)械拉伸能增加TSCs增殖、促進(jìn)TSCs成為腱細(xì)胞，然而8％的機(jī)械拉伸可誘導(dǎo)TSCs分化為脂肪、軟骨和骨細(xì)胞?？梢?，小的機(jī)械拉伸（有序和適度的體育鍛煉）可促進(jìn)TSCs增殖并成為腱細(xì)胞

4、，有利于肌腱的強(qiáng)壯及肌腱的健康;而持續(xù)較大的機(jī)械負(fù)荷（如過度勞損）是有害的，它促使肌腱干細(xì)胞分化為非腱細(xì)胞，導(dǎo)致脂肪堆積、黏液形成和肌腱鈣化，表現(xiàn)為肌腱病的典型病理變化。可見，TSCs可能是探索肌腱病的突破口。
　　 因?yàn)閷?duì)肌腱病還沒有本質(zhì)認(rèn)識(shí)，臨床治療還往往是經(jīng)驗(yàn)性的。治療方法包括:局部制動(dòng)休息、減負(fù)訓(xùn)練、按摩冷療、離心型運(yùn)動(dòng)、口服非甾體類抗炎藥物、局部注射富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、細(xì)胞

5、療法、體外沖擊波術(shù)、嚴(yán)重時(shí)可給予糖皮質(zhì)激素等治療。對(duì)于保守治療無效、臨床癥狀持續(xù)較重者，可給予外科手術(shù)治療。在這些治療方法中，PRP局部注射具有自體來源、制作簡單、可制作成凝膠狀、臨床使用安全、方便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，倍受醫(yī)生和患者的歡迎。因此，臨床應(yīng)用PRP局部注射治療“肌腱病”值得我們關(guān)注。
　　 PRP是全血經(jīng)過梯度離心分離獲得的、含有超過基線水平的濃縮血小板血漿。一般而言，血小板含量至少要達(dá)到正常血的3-5倍才能稱之為PRP。

6、當(dāng)PRP被激活后，其血小板釋放出大量的生長因子，包括血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，纖維生長因子(FGF)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(EGF)，血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PDEGF)，胰島素樣生長因子(IGF)等。這些生長因子對(duì)細(xì)胞的增殖和分化有著重要的作用，能夠刺激損傷組織血管神經(jīng)化、為細(xì)胞修復(fù)或再生損傷組織提供血供和營養(yǎng)。
　　 體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRP能促進(jìn)TSCs增

7、殖和成腱細(xì)胞形成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也已證實(shí)這一結(jié)果，一些臨床試驗(yàn)也已經(jīng)驗(yàn)證PRP能夠促進(jìn)肌腱和韌帶急慢性損傷的愈合和有效治療肌腱病。然而，PRP局部注射治療肌腱和韌帶的急慢性損傷和肌腱病并不總是令人滿意，有一些臨床試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)PRP對(duì)肌腱和韌帶急慢性損傷的修復(fù)和肌腱病的治療無益。因此，應(yīng)用PRP治療肌腱病仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)與臨床研究。
　　 我們知道，臨床應(yīng)用的PRP是個(gè)體化準(zhǔn)備的，沒有明確的定義。因而，每一個(gè)人的PRP都可能不一樣，并且

8、在某些情況下，有些病人不能成功獲得PRP。仔細(xì)分析PRP的制備過程及其組成成份，我們發(fā)現(xiàn)只有兩類（共有4種）不同的PRP在臨床使用;其中一類含白細(xì)胞(L-PRP和L-PRF)，另一類不含白細(xì)胞(P-PRP、P-PRF)。有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用富含白細(xì)胞的PRP有較乏白細(xì)胞的PRP更為嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)。因?yàn)門SCs是肌腱急慢性損傷修復(fù)的關(guān)鍵效用細(xì)胞，我們假設(shè)L-PRP不利于肌腱和韌帶的愈合是因?yàn)長-PRP會(huì)抑制TSCs的正常活性。
　　

9、 本課題為證實(shí)上述假設(shè)共分為3章，即肌腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定;P-PRP和L-PRP的制備和鑒定;P-PRP和L-PRP對(duì)TSCs增殖、分化和細(xì)胞力學(xué)的影響。研究目的是為臨床合理應(yīng)用PRP局部注射治療肌腱病提供理論依據(jù)。
　　 第一章兔肌腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:分離和鑒定兔肌腱干細(xì)胞(TSCs)并評(píng)估其干細(xì)胞特性為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。研究內(nèi)容包括:(1)TSCs的分離及培養(yǎng);(2)TSCs的克隆形成能力

10、及增殖能力檢測(cè);(3)TSCs的流式細(xì)胞儀及免疫熒光鑒定;(4)TSCs的成脂、成軟骨、成骨分化能力測(cè)定。
　　 方法:從新西蘭大白兔中獲取TSCs已經(jīng)匹茲堡大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用學(xué)會(huì)批準(zhǔn)(IACUC批準(zhǔn)號(hào):1105545A)。選用3月齡健康雄性新西蘭大白兔。兔處死后從后肢的跟腱取細(xì)胞并進(jìn)行TSCs培養(yǎng)，觀察克隆形成、進(jìn)行干細(xì)胞鑒定和到P3后行成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)7天后，肌腱來源細(xì)胞(Tendon-d

11、erived cells，TDCs)已經(jīng)形成克隆。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示TDCs表面抗原干細(xì)胞標(biāo)志CD90、CD44均呈強(qiáng)陽性。免疫熒光的方法對(duì)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物(NS，Nanog， Oct-4，SSEA4)進(jìn)行了檢測(cè)，染色細(xì)胞經(jīng)免疫熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示80％的TDCs細(xì)胞均表達(dá)陽性。成脂誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞中出現(xiàn)脂滴，并逐漸增大、融合，油紅-O染色可見細(xì)胞內(nèi)大小不等的紅色脂滴。成軟骨誘導(dǎo)分化4周

12、，固定細(xì)胞，經(jīng)番紅-O染色，細(xì)胞微團(tuán)被染為紅色。成骨誘導(dǎo)分化4周后，TDCs細(xì)胞呈層疊樣生長，局部出現(xiàn)鈣鹽沉積，形成礦化結(jié)節(jié)，鈣鹽沉積處Alizarin red S染色成紅色。
　　 小結(jié):本研究獲取的TDCs是肌腱干細(xì)胞(TSCs)，具有克隆形成能力及快速增殖能力，細(xì)胞表面抗原CD90、CD44表達(dá)呈陽性，而CD34表達(dá)呈陰性，干細(xì)胞特異性標(biāo)志物NS、Nanog、SSEA4和OCT-4表達(dá)陽性，在成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)條件下，

13、可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，具有多向分化潛能，可用于下一步研究。
　　 第二章 P-PRP和L-PRP的制備及P-PRP及L-PRP對(duì)TSCs的影響
　　 為了明確是否是PRP中的白細(xì)胞影響了PRP的療效，本研究將分別制備P-PRP和L-PRP及研究P-PRP與L-PRP對(duì)TSCs的作用，以進(jìn)一步確定L-PRP對(duì)肌腱韌帶修復(fù)的不利影響，明確P-PRP對(duì)肌腱韌帶修復(fù)的積極作用。
　　 方法:選用3月齡

14、、體重2.5kg的健康雄性新西蘭大白兔8只(匹茲堡大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，IACUC Protocol number:1105545A)，乙醚麻醉后，在嚴(yán)格無菌條件下，用預(yù)先含有3.8％ACD抗凝劑(sodium citrate)溶液的注射器從心臟采集新鮮抗凝血并置于冰水混合物中。小心緩慢地將6mL的新鮮血注入盛有6mL Polymorphprep(Accurate Chemical&Scientific Crop NY)的試管中，置4℃

15、離心機(jī)中予以400g/m離心30分鐘后手工分離出P-PRP和L-PRP，應(yīng)用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC，Lawrence，Massachusetts)對(duì)P-PRP和L-PRP所含的白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。P-PRP和L-PRP均用22mM CaCL2進(jìn)行激活并存于4℃冰箱中備下一步實(shí)驗(yàn)用。將準(zhǔn)備好P-PRP和L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中除含或未含P-PRP或L-PRP外，其他成分一樣（20％胎牛血清

16、、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、低糖DMEM），分析各培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子;將兔來源的TSCs接種在含P-PRP、L-PRP(0％，2％，5％，10％)培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中(10000個(gè)細(xì)胞/孔)并在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng);培養(yǎng)至1、2、4天觀察細(xì)胞形態(tài)，至第4天用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC，Lawrence，Massachusetts)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算PDT，流式細(xì)胞

17、儀檢測(cè)其干細(xì)胞特征性細(xì)胞表面標(biāo)志物;觀察P-PRP組、L-PRP組和對(duì)照組TSCs經(jīng)成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)28天后其多分化潛能;qRT-PCR分析P-PRP和L-PRP對(duì)TSCs基因表達(dá)的影響，PRP與白細(xì)胞對(duì)TSCs的相互影響;CTFM測(cè)定P-PRP和L-PRP對(duì)TSCs細(xì)胞力學(xué)的影響。
　　 結(jié)果:加入離心液一次梯度離心可制備高濃度的PRP。PRP中的血小板量為1.44×108±0.84×108/mL(P＜0.05)，與全血

18、比較，其血小板濃縮率為3.25±0.73。P-PRP中的白細(xì)胞數(shù)為0.6625×105±0.36×105/mL，L-PRP中的白細(xì)胞數(shù)為3.2775×105±1.22×105/mL(P=0.019)(mean±SD，n=8)。所有培養(yǎng)基(P-PRP培養(yǎng)基、L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基)均在配制好后即用ELISA法測(cè)定其生長因子(PDGF, EGF, TGF-β1，VEGF)的濃度。P-PRP培養(yǎng)基有較L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基更高濃度

19、的生長因子，特別是EGF和TGF-β1。L-PRP培養(yǎng)基中VEGF濃度較普通培養(yǎng)基還低，說明白細(xì)胞可能抑制PRP釋放生長因子(P-PRP與L-PRP培養(yǎng)基比較，P＜0.05，n=3); L-PRP培養(yǎng)基組不貼壁細(xì)胞增加;其干細(xì)胞特征性細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD90發(fā)生變化，經(jīng)P-PRP處理，CD44和CD90都表達(dá)增加，經(jīng)L-PRP處理則相反(P-PRP與L-PRP組比較，P＜0.05，n=3); PDT與PRP白細(xì)胞的濃度有關(guān)，當(dāng)增

20、加P-PRP的濃度或降低L-PRP濃度時(shí)，PDT縮短（組內(nèi)和組間比較，P＜0.05，n=3）;培養(yǎng)4天、14天后，L-PRP的濃度越高，Nanog、Oct4基因表達(dá)越下調(diào)(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較，P＜0.05，n=3);經(jīng)28天的成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)后，P-PRP培養(yǎng)基組、L-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組的TSCs均被成功誘導(dǎo)。然而，L-PRP培養(yǎng)基組陽性細(xì)胞染色數(shù)明顯較P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組。與P-

21、PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組比較，L-PRP培養(yǎng)基組成脂、成軟骨和成骨分化明顯增加（組內(nèi)比較，P＜0.05，n=3）;各基因與P-PRP和L-PRP的濃度密切相關(guān)。L-PRP的存在，PPARγ、SOX-9、Runx-2、mPGEs基因表達(dá)就明顯上調(diào)。(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較，P＜0.05，n=3); L-PRP培養(yǎng)基組的最大細(xì)胞收縮力明顯小于P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組，組間比較有顯著性差異(P=0.006、

22、0.002，n=5)，但P-PRP培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基比較則未見顯著性差異(P=0.609、0.002，n=5); WBC組的COX-1和COX-2基因明顯上調(diào)，但WBCs的這種作用可以明顯被PRP抵消;PRP組Ⅰ型膠原基因(Col-I)表達(dá)上調(diào)，但這種作用可以明顯被WBC處理抑制;WBC組還明顯有MMP-13基因表達(dá)的增加，這種表達(dá)增加可以被PRP抵消。
　　 小結(jié):本研究中通過加入離心液一次梯度離心分離制備出P-PRP和L-

23、PRP，其所含的白細(xì)胞有顯著的差異。與P-PRP和空白對(duì)照比較，L-PRP會(huì)抑制TSCs的增生、加速TSCs的分化、并使TSCs脆性增加;經(jīng)WBCs處理后，TSCs的炎癥反應(yīng)介質(zhì)基因COX-1和COX-2表達(dá)增加，細(xì)胞分解代謝的基因Ⅰ型膠原表達(dá)減少但MMP-13表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)支持臨床所見的肌腱病發(fā)病機(jī)制，因而，我們可以合理地推斷P-PRP可以促進(jìn)肌腱韌帶的愈合而L-PRP可能抑制肌腱韌帶的愈合。因此，我們應(yīng)該用P-PRP而不是含有白

24、細(xì)胞的L-PRP治療肌腱病。
　　 第三章 P-PRP膠-TSCs復(fù)合物的構(gòu)建及TSCs的體內(nèi)、外示蹤
　　 將P-PRP膠作為載體負(fù)載TSCs構(gòu)建成P-PRP膠-TSCs復(fù)合物并植入目標(biāo)部位，并監(jiān)測(cè)TSCs植入體內(nèi)后其生物學(xué)活性。
　　 方法:應(yīng)用SPIO標(biāo)記TSCs、分析SPIO對(duì)TSCs生物學(xué)功能的影響;構(gòu)建P-PRP膠-TSCs復(fù)合物;體外MRI觀察經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs在P-PRP膠內(nèi)的分布情況;建立

25、兔髕韌帶窗式缺損模型，用P-PRP膠-TSCs復(fù)合物進(jìn)行修復(fù)，MRI連續(xù)檢測(cè)追蹤經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs并檢驗(yàn)P-PRP膠作為載體的可行性;免疫熒光檢測(cè)評(píng)價(jià)P-PRP膠-TSCs植入體內(nèi)3周后其TSCs的Ⅰ型膠原合成能力，以觀察TSCs植入體內(nèi)3周后的生物學(xué)性能;明確P-PRP膠作為TSCs載體用于治療急慢性肌腱損傷和肌腱病的可行性。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)TSCs經(jīng)胞吞作用攝入SPIO，可見SPIO在細(xì)胞漿內(nèi)并圍繞在細(xì)胞核周圍。

26、細(xì)胞標(biāo)記率約98％。經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變;細(xì)胞增殖也未見明顯改變，表現(xiàn)為PDT與未標(biāo)記TSCs比較無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說明SPIO標(biāo)記不會(huì)影響細(xì)胞的增殖功能;分別于標(biāo)記后2、4、7天檢測(cè)細(xì)胞的活力，發(fā)現(xiàn)其活力都在90％左右，與未標(biāo)記細(xì)胞比較也無明顯差異，說明SPIO標(biāo)記不會(huì)明顯干擾TSCs的細(xì)胞活力(P＞0.05);經(jīng)免疫組織化學(xué)方法證實(shí)SPIO標(biāo)記組TSCs和未標(biāo)記組nucleostemin和N

27、anog表達(dá)率都為約90％，沒有明顯差別(P＞0.05);經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)標(biāo)記TSCs和未標(biāo)記TSCs相比，在標(biāo)記后4、7、14天，其Oct-4和Nanog基因表達(dá)都沒有明顯差別(P＞0.05);經(jīng)21天的成脂、成軟骨和成骨分化，兩組未見明確差異;其PPAR、Sox9和Runx2基因表達(dá)也無明顯差異(P＞0.05)。體外P-PRP膠-TSCs復(fù)合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs其MRI信號(hào)與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)呈線性改

28、變，說明TSCs可均勻分散在P-PRP膠中;體內(nèi)P-PRP膠-TSCs復(fù)合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs連續(xù)3周其MRI信號(hào)沒有明顯變化。術(shù)后3周局部表現(xiàn)為肌腱缺損已有組織填充，經(jīng)普魯氏蘭染色證實(shí)MRI顯影的細(xì)胞就是經(jīng)SPIO標(biāo)記的TSCs，說明TSCs能持續(xù)停留在目標(biāo)部位至少3周。從組織修復(fù)的角度考慮，3周的時(shí)間足于完成急性炎癥期，目的細(xì)胞能停留在目標(biāo)部位3周以上就可能發(fā)揮其生理功能，達(dá)到治療目的。再次，經(jīng)免疫組織化學(xué)

29、染色證實(shí)P-PRP膠負(fù)載的TSCs在體內(nèi)3周后出現(xiàn)明顯的Ⅰ型膠原的表達(dá)，說明TSCs已經(jīng)發(fā)揮生理作用?？梢奝-PRP膠可以作為TSCs細(xì)胞治療或組織工程的載體。
　　 小結(jié):用SPIO標(biāo)記TSCs不會(huì)明顯干攏其干性、負(fù)載TSCs的P-PRP膠修復(fù)兔髕韌帶窗式缺損術(shù)后2周和3周連續(xù)經(jīng)MRI觀察均未見明顯影像學(xué)改變、經(jīng)普魯氏蘭染色證實(shí)MRI顯影的細(xì)胞就是SPIO標(biāo)記的TSCs，說明存在于P-PRP膠內(nèi)作為目的細(xì)胞的TSCs可以穩(wěn)定維

30、持在目標(biāo)部位，且TSCs植入體內(nèi)3周后能合成Ⅰ型膠原，說明TSCs可用SPIO進(jìn)行標(biāo)記、P-PRP膠可作為TSCs的良好載體。
　　 結(jié)論:本研究成功地從兔跟腱分離培養(yǎng)出TDCs。這些細(xì)胞有克隆形成能力、快速增殖能力和多向分化潛能，經(jīng)流式細(xì)胞儀證實(shí)干細(xì)胞表面特征性標(biāo)志物陽性，經(jīng)免疫熒光染色證實(shí)干細(xì)胞特征標(biāo)志物染色陽性，從而確定為肌腱干細(xì)胞;經(jīng)一次離心可簡便制備出較高濃度的PRP并成功分離出P-PRP和L-PRP;發(fā)現(xiàn)L-PRP，