深低溫冷凍對(duì)大鼠髕腱組織內(nèi)肌腱干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的:
　　探究深低溫冷凍處理對(duì)大鼠髕腱組織中肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)的細(xì)胞存活率、細(xì)胞活力、細(xì)胞早期凋亡率、細(xì)胞遷移能力及肌腱相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)組將6只4月齡SD大鼠的髕腱組織取出，置入含有冷凍保護(hù)液的凍存管中，放入冰箱4℃中2小時(shí)，-80℃中過(guò)夜，投入液氮中保存一星期后取出進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)照組將相同條件的大鼠髕腱組織取出后不作任何處理直接細(xì)

2、胞培養(yǎng)。無(wú)菌條件下將兩組髕腱組織用Ⅰ型膠原酶(3mg/ml，Sigma)消化獲得有核細(xì)胞，分別用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)有核細(xì)胞存活率;結(jié)晶紫染色檢測(cè)有核細(xì)胞克隆形成能力;同等條件下將細(xì)胞培養(yǎng)到第3代(P3)，用AlamarBlue法檢測(cè)肌腱干細(xì)胞體外增殖能力;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡狀態(tài);Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)細(xì)胞肌腱相關(guān)基因Col1α1、S

3、cx和Tnmd的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　與對(duì)照組相比，經(jīng)深低溫冷凍后的髕腱組織來(lái)源的有核細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組原代有核細(xì)胞中均有細(xì)胞克隆的形成，證實(shí)均可成功分離培養(yǎng)鑒定出具有克隆形成能力的肌腱干細(xì)胞，但髕腱組織經(jīng)深低溫冷凍后肌腱干細(xì)胞數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組肌腱干細(xì)胞(P3)培養(yǎng)14天過(guò)程中觀察到細(xì)胞增殖活力相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

4、5);同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第3代肌腱干細(xì)胞早期凋亡率、細(xì)胞遷移能力、肌腱分化相關(guān)基因表達(dá)量相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　深低溫冷凍使大鼠肌腱組織內(nèi)有核細(xì)胞的存活率降低，但肌腱組織仍保留大量有活性的干細(xì)胞。盡管實(shí)驗(yàn)組中肌腱干細(xì)胞的數(shù)量有所下降，但和對(duì)照組中肌腱干細(xì)胞相比，其細(xì)胞增殖能力(P3)、早期凋亡率、體外遷移能力及成肌腱分化能力未見(jiàn)明顯異常。研究可為臨床應(yīng)用深低溫冷凍保存的同種異體肌腱移植修