不同濃度富血小板血漿對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響.pdf

1、種植在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用已將近40年，目前大多數(shù)學(xué)者承認(rèn)和接受的種植體界面是指種植體與骨的接觸界面。自1960年Branemake提出了種植體界面骨整合理論，將其定義為負(fù)載的種植體表面與周圍發(fā)育良好的骨組織之間在結(jié)構(gòu)和功能上的直接結(jié)合，即骨性結(jié)合。它成為評價(jià)種植體成功與否的標(biāo)準(zhǔn)之一，也是當(dāng)前種植義齒修復(fù)的基礎(chǔ)。因?yàn)榉N植體與周圍組織的骨形成和骨改建都通過細(xì)胞來完成，所以目前種植義齒修復(fù)治療的研究已經(jīng)逐步的由單純的炎癥控制發(fā)展為如何促進(jìn)種植體周圍

2、細(xì)胞的增殖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow stromal cells，BMSCs)是一種具有較強(qiáng)自我更新能力和多向分化潛能的組織工程的種子細(xì)胞，它在不同的誘導(dǎo)條件下能分化為成熟的間質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，如何在短時(shí)間內(nèi)在體外獲得大量的種子細(xì)胞，是組織工程的關(guān)鍵任務(wù)之一。富血小板血漿(platelet-rich plasma PRP)是通過離心自體全血所得到的血小板濃縮物，當(dāng)血小板被激活后，a粒子釋放出多種與骨再生有

3、關(guān)的生長因子，這些生長因子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、趨化和刺激血管化等多方面作用。利用血小板生長因子刺激促進(jìn)種植體周圍骨再生，修復(fù)種植體周圍骨缺損是國際口腔種植學(xué)界研究的熱點(diǎn)。試圖通過富血小板血漿在口腔種植中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，探討PRP對骨整合的作用機(jī)制，評估其促進(jìn)骨組織再生的效果。 目的：探討不同濃度的富血小板血漿(PRP)在不同時(shí)間段對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響，探索兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒

4、定的方法及生長動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究PRP在口腔種植義齒修復(fù)中的作用機(jī)制，為臨床種植義齒運(yùn)用PRP加快種植體周圍骨整合的速度，縮短修復(fù)治療時(shí)間提供理論依據(jù)。 方法：利用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化、擴(kuò)增。用倒置顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)變化，繪制生長曲線，檢測細(xì)胞活力，通過免疫熒光組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀技術(shù)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，利用PRP提取技術(shù)，在高倍光鏡下人工計(jì)數(shù)血小板個(gè)數(shù)，用雙抗體夾心A

5、BC～ELISA法測定PDGF和TGF-β生長因子濃度，用四唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度的PRP(0％，0.5％，1.0％，1.5％)在不同作用時(shí)間(24h，48h，72h)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響。 結(jié)果：1、PRP中血小板濃度為9.3×105/mm3，PRP中血小板濃度為全血的3.18倍。PRP 中TGF-β和PDGF生長因子的濃度為全血的3.40倍。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)分離后臺盼藍(lán)拒染法測定，活細(xì)胞的比例達(dá)9

6、5％以上。3、從原代細(xì)胞生長曲線上看出，原代培養(yǎng)時(shí)間潛伏期較長，一般為4～5d，8d左右進(jìn)入對數(shù)生長期，14d左右進(jìn)入平臺期，細(xì)胞增殖速度趨于平緩。從2、5、8代細(xì)胞生長曲線上看出，傳代細(xì)胞生長潛伏期只有1～2d，3～4d進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖迅速，持續(xù)4～5d；7～8d進(jìn)入平臺期，而且隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的生長速度逐漸緩慢，至接種后第9天計(jì)算所得的細(xì)胞數(shù)目P8

7、始相差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見附表。經(jīng)SNK檢驗(yàn)，每天的2、5、8代細(xì)胞數(shù)目之間兩兩比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明細(xì)胞增殖能力隨細(xì)胞傳代而有所下降。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD90，反復(fù)傳代后表達(dá)效率增高，不表達(dá)CD34；透射電鏡可見細(xì)胞表面有大量的絨毛突起，胞漿中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，核大，形態(tài)不規(guī)則。4、經(jīng)方差分析，相對于對照組，各實(shí)驗(yàn)組所測得A值有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)：經(jīng)SNK法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)