富血小板血漿與1,25雙羥維生素D3對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響.pdf

1、第一部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：分離、培養(yǎng)及純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs),并進(jìn)行鑒定。
　　 方法：采用髂骨穿刺抽取骨髓,密度剃度離心法提取、分離hBMSCs進(jìn)行培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察原代及傳代培養(yǎng)的hBMSCs的生長情況,熒光激活細(xì)胞分選術(shù)鑒定細(xì)胞表面分子,體外誘導(dǎo)其向成骨、成軟骨、成脂肪分化。
　　 結(jié)果：1、hBMSCs在接種48小時(shí)后,貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形、成纖維細(xì)

2、胞樣形態(tài),大小均一;傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)更加均一,呈克隆樣生長。2、hBMSCs表面標(biāo)記鑒定:第2代純度可達(dá)98％以上,其細(xì)胞表型CD34、CD45為陰性;CD29、CDl05為陽性。3、hBMSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后可以向成骨、成軟骨、成脂肪分化。
　　 結(jié)論：密度剃度離心法是提取、分離hBMSCs的好方法,hBMSCs易于體外分離培養(yǎng),增殖旺盛,能夠保持間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,經(jīng)體外誘導(dǎo)后可以向成骨、成軟骨、成脂肪分化。
　　

3、 第二部分、富血小板血漿的制備、鑒定
　　 目的：探討二次離心法制備富血小板血漿(PRP)的效果,并對(duì)其進(jìn)行鑒定,為PRP的使用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從3位志愿者肘前靜脈取血35ml,采用Landesberg法制備PRP,對(duì)其進(jìn)行血小板計(jì)數(shù),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定活化后轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)與血小板源性生長因子(PDGF)濃度,掃描電鏡觀察活化PRP的形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：Landesberg法

4、制備的PRP中血小板濃度較正常5倍以上,活化后可釋放高濃度的TGF-β1和PDGF,其量與PRP中所含的血小板濃度呈正相關(guān)。掃描電鏡觀察PRP活化后,血小板表面有許多顆粒狀突起。
　　 結(jié)論：Landesberg法是制備PRP的可靠方法,PRP活化后會(huì)釋放大量的生長因子,且與其所含的血小板濃度呈正相關(guān)。
　　 第三部分、富血小板血漿對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響
　　 目的：研究富血小板血漿(PRP)對(duì)人

5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hLBMSCs)增殖與成骨分化的影響,為RPP的體內(nèi)外研究及應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法：髂骨穿刺采集、分離及培養(yǎng)hBMSCs,Landesberg法制備PRP,按其較正常血小板濃度依次稀釋為PRP-4.5x,PRP-3.5x,PRP-2.5x,PRP-1.0x,CCK-8法檢測不同濃度PRP對(duì)hBMSCs增殖的影響,堿性磷酸酶(ALP)活性,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物基因Runx2,Osx,CO

6、L1A1,OPN,ALP的mRNA表達(dá),Western印跡檢測Runx2蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：不同濃度PRP對(duì)hBMSCs增殖均有促進(jìn)作用,以PRP-1.0x和PRP-2.5x最為明顯,PRP抑制了ALP活性,抑制了成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物Runx2,Osx,COL1A1,OPN,ALP基因的mRNA表達(dá)和Runx2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：PRP促進(jìn)了hBMSCs的增殖,低濃度更利于細(xì)胞增殖,PRP抑制了hBMSCs的

7、成骨分化。
　　 第四部分、富血小板血漿與1,25雙羥維生素D3對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響
　　 目的：研究富血小板血漿(PRP)與1,25雙羥維生素D3(1,25(OH)2D3)聯(lián)合作用對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hB3MSCs)增殖與成骨分化的影響,為兩者在體內(nèi)外的聯(lián)合應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：髂骨穿刺采集、分離及培養(yǎng)hBMSCs,Landesberg法制備PRP,將PRP01.0x與1,25(O

8、H)2D3(50 nM)聯(lián)合作用于hBMSCs,采用CCK-8法檢測對(duì)增殖的影響,堿性磷酸酶(ALP)活性與染色,實(shí)時(shí)定量PCR及Western印跡檢測成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物Runx2,Osx,COL1A1,OPN,ALP的表達(dá);PRP-1.0x與1,25(OH)2D3序貫作用檢測ALP活性的變化。
　　 結(jié)果：PRP-1.0x促進(jìn)了hBMSCs增殖,1,25(OH)2D3聯(lián)抑制了細(xì)胞增殖,兩者聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞增殖介于兩者之間。PRP